In this study, the aim was to achieve high concentration of recombinant human growth hormone (rhGH) production by recombinant Pichia pastoris by investigating the effects of various operation parameters and to determine the suitable peptide ligand sequence that shows affinity and specificity to hGH. In this context, firstly the effect of temperature and Tween-20/80 addition on production and cell growth were investigated. While at T=30 and 32°C, there was no difference, at 27 and 25°C cell growth slowed down and production decreased significantly. The addition of Tween-20/80 in existence of co-substrate sorbitol did not affect the bioprocess while in absence of sorbitol Tween alone did not show the same positive effect on product formation and cell growth.Thereafter at T=30°C, without addition of Tween, three sets of pilot scale bioreactor experiments were performed. In the first set, the effect of methanol feeding rate on bioprocess characteristics were investigated at the specific growth rates of ?=0.02, 0.03 and 0.04 h-1. While the highest cell concentration was achieved at ?=0.04 h-1, the highest rhGH concentration was achieved at ?=0.03 h-1. Secondly, conducting methanol feeding at ?=0.03 h-1, pH=5.5 experiment was conducted. The highest cell concentration, 45 g L-1 and maximum rhGH concentration 0.25 g L-1 were achieved at t=18 h of the process. Finally, the effect of batch sorbitol feeding on bioprocess was observed by the addition of 50 g L-1 sorbitol at t=0, 14 and 31 h of the production phase. It was shown that sorbitol addition to the medium increased process duration; hence cells enter stationary phase after a longer production phase. However, the protease concentration continued increasing with respect to time and at the end of the process reached twice the concentration it was obtained with single sorbitol addition case decreasing the rhGH concentration.In selection of the peptide sequence that shows affinity towards hGH, phage display method was conducted. Additionally the sequences from literature and computational design were used as alternatives. The interaction between these peptides and hGH was investigated by isothermal titration calorimetry and surface plasmon resonance.

Bu çalışmada, Pichia pastoris ile çeşitli üretim parametrelerinin rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) üretimine etkileri yüksek derişimde ürün üretimini sağlamak amacıyla araştırılmış ve insan büyüme hormonuna afinite ve spesifiklik gösteren peptit dizinlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, çalışmanın ilk bölümünde sıcaklığın ve üretim ortamına Tween-20/80 eklenmesinin rhGH üretimi ve hücre çoğalmasına etkileri araştırılmıştır. T=30 ve 32°C koşulları arasında bir fark görülmezken, 27 ve 25oC'de hücre çoğalmasının yavaşladığı ve dolayısıyla üretimin belirgin düzeyde azaldığı görülmüştür. Sorbitolün ikinci karbon kaynağı olarak kullanıldığı durumda ortama ek olarak Tween-20/80 eklenmesinin biyoprosesi etkilemedigi ve sorbitolün ortamda bulunmadığı durumlarda yalnızca Tween eklenmesinin, sorbitol eklenmesi ile ayni pozitif etkiyi yapmadığı gözlemlenmiştir.Bu çalışmanın sonrasında T=30°C'de ve Tween ilavesi yapılmadan, üç set laboratuvar ölçekli biyoreaktör deneyi yapılmıştır. İlk sette, metanol besleme hızının biyoproses karakteristiklerine etkisi ?=0.02, 0.03 ve 0.04st-1 spesifik hücre çoğalma hızlarında incelenmiştir. En yüksek hücre derişimine ?=0.04 st -1 koşulunda ulaşılırken, en yüksek ürün derişimi ?=0.03 st -1 koşulunda elde edilmiştir. İkinci olarak, ?=0.03 st -1 e bağlı olarak belirlenen methanol besleme profili kullanılarak, pH=5.5 koşulu denenmiştir. En yüksek hücre derişimine, 45 g L-1, ve maksimum rhGH derişimine, 0.25 g L-1, t=18 st'te ulaşılmıştır. Son olarak, kesikli olarak sorbitol eklenmesinin biyoprosese etkisi 50 g L-1 sorbitolun üretim fazının t=0, 14 ve 31 st' lerinde kesikli olarak eklenmesi ile araştırılmıştır. Ortama sorbitol eklenmesinin üretim süresini uzattığı, böylelikle hücrelerin durağan faza daha geç ulaştığı gösterilmiştir. Ancak, üretim süresi uzadıkça artmaya devam eden proteaz derişimi, proses sonunda tek sefer kesikli sorbitol eklendiği koşuldaki ile proses sonunda görülen proteaz miktarının iki katına çıkmış; proses sonunda elde edilen rhGH derişiminde azalma görülmüştür.hGH'ye afinite gösterebilecek peptit dizinlerinin seçiminde faj display yöntemi kullanılmıştır. Buna ek olarak, literatürde bulunan ve bilgisayar ortamında dizayn edilen peptitler de alternatif dizinler olarak kullanılmıştır. Peptitler ve hGH etkileşimi izotermal titrasyon kalorimetre ve yüzey plasmon rezonans cihazları ile incelenmiştir.