Plasmodium vivax and Theileria annulata are apicomplexan parasites which affects human and cattle, respectively, and cause morbidity and mortality. Especially Plasmodium lactate dehydrogenase has been widely used as target antigen to produce rapid diagnostic tests (RDT) for malaria. T. annulata detection is based on microscopical examinations. However, rapid diagnostics to detect T. annulata tests have not been presented in the literature yet. In this study, development of an assay system to detect apicomplexans either T. annulata or P. vivax in a single test by using previously produced antibody against P. falciparum was performed with the ultimate aim of developing a RDT test against T. annulata. Identity of PfLDH to PvLDH and TaLDH are 90.2 %, 50 %, respectively, at the amino acid level. As the P. vivax is the most common species in Turkey, PvLDH was planned to be used as control in studies of immunodot enzyme assay which is an immunodiagnostic test that detects infections by enzyme substrate reactions based on antibody antigen interaction. The gene encoding PvLDH was previously inserted into pKK223-3 expression vector and then expressed in E. coli DH5α cells. However, the test system showed that recombinant vector system was not able to produce LDH anymore. In order to overcome this problem PvLDH gene was subcloned into pLATE31 vector in aLICator ligation independent cloning and expression system. To this end, PvLDH gene was amplified, subcloned into expression vector pLATE31 and availability of the correct LDH sequence was confirmed by sequencing. Protein was then, expressed and purified by affinity chromatography. As a result, PvLDH was expressed at high levels and made available for further assay system. TaLDH in pLATE31 vector in E. coli BL21(DE3) was also purified and used in the immunodot assay system. Establishment of the assay system for detection of either PvLDH or TaLDH was performed. Positive reactions were observed with immunodot enzyme assay for both LDHs. Limit of detection for PvLDH and TaLDH rapid tests were determined as 0.1 μg/ml and 2 μg/ml, respectively, by Western Blot analysis. The reaction possibility of the suggested RDT is confirmed by immunodot enzyme assay. To the best of our knowledge, theileriosis immunodot assay by LDH enzyme is the first step for description of RDT to detect theileriosis.The obtained information from immunodot enzyme assay could allow further studies towards development of a single rapid theileriosis diagnostic test based on the parasite LDH.

Plasmodium vivax ve Theileria annulata sırasıyla insan ve sığırları etkileyen morbiditeye ve mortaliteye sebep olan apikompleksan parazitleridir. Özellikle, Plasmodium laktat dehidrogenazı, sıtma hızlı tanı testlerinin üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. T. annulata tanısı mikroskobik incelemeler ile yapılmakta olup literatürde henüz T. annulata'yı tanıyan bir hızlı tanı testi sunulmamıştır. Bu çalışmada, P. falciparum'a karşı üretilmiş antikorlar kullanılarak iki apikomplexandan, T. annulata veya P. vivax tanısını mümkün kılabilecek ortak bir hızlı tanı testi geliştirilmesi için assay sistemi oluşturuldu. Oluşturulan testin nihai amacı T. annulata'ya karşı hızlı tanı testi geliştirilmesidir. PfLDH'ın PvLDH'a ve TaLDH'a karşı aminoasit düzeyinde benzerlik oranı, sırasıyla, 90.2 %, 50 %'dir. P. vivax Türkiye'deki en yaygın tür olduğundan, PvLDH'ın antikor antijen etkileşimine dayanarak enzim substrat reaksiyonları ile enfeksiyonların tanısını sağlayan immünolojik bir test olan immunodot enzim sisteminde kullanılması planlanmıştır. PvLDH'ı kodlayan gen önceki çalışmalarda pKK223-3 ekspresyon vektörüne yerleştirilmiş ve sonra E. coli DH5α hücrelerinde ekspresyonu yapılmıştır. Fakat test sistemi, rekombinant vektör sisteminin LDH'ı artık üretemediğini göstermiştir. Bu problemin üstesinden gelebilmek için PvLDH geninin aLICator klonlama ve ekspresyon sistemindeki pLATE31 ekspresyon vektörüne alt-klonlaması yapıldı. Bu amaçla, PvLDH geni amplifiye edildi ve doğru LDH dizisinin kullanılabilirliği dizileme ile doğrulandı. Sonrasında, protein eksprese edildi ve afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Sonuç olarak, PvLDH yüksek seviyede eksprese edildi ve ileriki assay sisteminde kullanılabilir oldu. Ayrıca, pLATE31 vektöründeki E. coli hücrelerindeki TaLDH da saflaştırıldı ve immunodot assay sisteminde kullanıldı. Assay sisteminin PvLDH ve TaLDH için tanımlanması gerçekleştirildi. İmmunodot enzim assay ile PvLDH veya TaLDH için pozitif reaksiyonlar gözlemlendi. PvLDH ve TaLDH tanı testi için en düşük tanı sınırı Western Blot ile sırasıyla 0.1 μg/ml ve 2 μg/ml olarak belirlendi. Önerilen hızlı tanı testlerinin reaksiyon olasılığı immunodot enzim assay ile doğrulandı. Bilgimiz dahilinde, LDH kullanılarak tasarlanan immunodot assay, theileriosis için tanımlanan hızlı tanı testilerinin ilk adımıdır.Immunodot enzim assay ile elde edilen bilgiler, parazit LDH'ına dayalı hızlı theileriosis tanı testlerinin geliştirilmesine yönelik gelecekteki çalışmalara imkan vermektedir.