In this study, tri4 and tri5 genes associated with trichothecene biosynthesis in Fusarium species were quelled with siRNA mediated mechanism. RNAi was triggered by six siRNA molecules designed specific to exonic sites of the genes in F. graminearum 4F and F. culmorum 9F and 20F isolates. For this purpose, effects of different in vitro conditions on tri4 and tri5 expression were investigated in 38 Fusarium isolates. Fusarium cultures grown on pH 5.6 and at 25°C was used as control group. Effects of temperature on trichothecene production was tested by cultivating of mycelia on medium with pH value of 5.6 at 8°C and 15°C. Also, the effects of pH was investigated by cultivating the Fusarium species on medium with pH 3.0 and 7.0 at 25°C. Another factor effecting trichothecene production was addition of H2O2 (0.5 mM) to medium. Maximum tri4 and tri5 expression levels were determined in control groups. Maximum expression levels of tri4 and tri5 genes were detected in 4F among screened 14 F. graminearum isolates. While the highest tri4 expression was determined in 20F among 24 F. culmorum isolates, maximum tri5 expression was found in 9F. Consequently, these three isolates were selected for induction of RNAi mechanism. In order to design specific siRNA molecules, full length tri4 and tri5 fragments were amplified from 4F, 9F and 20F isolates, sequenced and subjected to CLUSTALW analysis. Sequencing results revealed that there was high levels of similarity (94-99%) between tri4/tri5 genes belonging to reference genome and gene sequences that of 4F, 9F and 20F isolates. Sequence data belonging to two genes of these three isolates were deposited under database by gaining accession numbers (KJ677970, KJ677971, KJ677972, KJ677973, KJ677974 and KJ677975). siRNA molecules used in study were generated according to these sequence data via bioinformatic tools. Among hypothetically identified 60 exonic siRNA molecules, four siRNA for tri4 (Tri4E1:5'-ACAATACGGGCGTGAGTCATGTCAA-3', Tri4E2:5'-GAACCCTGAGAGAAGTTGGTGATGT-3', Tri4E3:5'-ACATGCTCCTTGTACTTCAAGTTCT-3', Tri4E4:5'-CATCTTGGAGATCTCCCAGAGAT-3') and two siRNA for tri5 gene (Tri5E1:5'-AAGCGACTACAGGCTTCCCTCCAAA-3', Tri5E2:5'-CAGGATCTGATGACTACCCTCAATT-3') were selected for using in quelling. These six double stranded siRNA were co-transfected as a single or multiple together with helper plasmids (pEGFP75 and pAN7-1) into protoplast cultures with totally 30 combinations for tri4 and six for tri5. Transfection efficiency was found ranged from 500.00 to 99.3310.06/5x104 in 36 experimental sets. Transfectants were selected by fluorescence microscopy and spectrofluorimetric analysis. Fluorescence emitting by GFP protein in cells was measured as spectrofluorimetrically. RFU (relative fluorescence unit) values of transfectants were found between 1.37±0.07 and 2.89±0.06. Besides, PCR was used in selection of transfectants with pAN7-1 and pEGFP75. For that purpose, 0.7 kb fragments of hph gene in pAN7-1 plasmid and GFP gene in pEGFP75 plasmid were amplified. Nearly a hundred per cent tri4 suppression in 30 experimental sets was shown by real time PCR analysis. Down regulation of tri5 gene for both of two species was detected as 65-95% in remaining 6 experiment groups. At the same time, it was shown that DON mycotoxin, final product of trichothecene biosynthesis, was not produced in tri4 and tri5 silenced Fusarium samples by thin layer chromatography. As a result, it was demonstrated that both tri4 and tri5 genes could be used in quelling of trichothecene biosynthesis pathway, in this study. Moreover, it was concluded that tri4 gene could be more useful target than tri5 for RNAi. It was thought that significant decreases in the expressions of tri4 and tri5 genes observed as a result of siRNA transfection were carried out in post-transcriptional level in Fusarium species. This study has a great importance in terms of being not only the first report related to siRNA mediated gene silencing in Fusarium species but also an applicable model in struggling with phytopathogenic species.

Bu çalışmada Fusarium türlerinde trikotesen biyosentezi ile ilişkili tri4 ve tri5 genleri siRNA aracılı mekanizma ile susturuldu. RNAi, F. graminearum 4F ve F. culmorum 9F ve 20F izolatlarında genlerin ekzonik bölgelerine özgün olarak tasarlanan altı siRNA molekülü ile tetiklendi. Bu amaçla, 38 Fusarium izolatında farklı in vitro koşulların tri4 ve tri5 anlatımı üzerindeki etkileri incelendi. pH 5.6 ve 25°C'de üretilen Fusarium kültürleri kontrol grubu olarak kullanıldı. Sıcaklığın trikotesen üretimine etkisi, miselyumun pH değeri 5.6 olan besi ortamında, 8°C ve 15°C'de kültüre edilmesi ile test edildi. pH'nın etkisi ise, Fusarium türlerinin pH değeri 3.0 ve 7.0 olan besi ortamlarında, 25°C'de kültüre edilmesi ile araştırıldı. Trikotesen üretimine etkisi denenen bir diğer parametre ortama H2O2 (0.5 mM) eklenmesidir. En yüksek tri4 ve tri5 anlatım düzeyleri kontrol grubunda belirlendi. Taranan 14 izolat arasında en yüksek tri4 ve tri5 geni anlatım düzeyi F. graminearum 4F'de saptandı. En yüksek tri4 anlatımı 24 F. culmorum izolatı arasından 20F'te belirlenirken, maksimum tri5 anlatımı 9F'te bulundu. Dolayısıyla, bu üç izolat RNAi mekanizmasının indüksiyonu için seçildi. Tam boydaki tri4 ve tri5 fragmentleri, özgün siRNA moleküllerini tasarlamak için 4F, 9F ve 20F izolatlarından çoğaltıldı, dizilendi ve CLUSTALW analizine tabi tutuldu. Dizileme sonuçları referans genoma ait tri4/tri5 genleri ile 4F, 9F ve 20F izolatlarına ait gen dizilimleri arasında yüksek düzeyde (%94-99) benzerlik olduğunu ortaya koydu. Bu üç izolatın iki genine ait dizilim bilgileri aksesyon numaraları alınarak (KJ677970, KJ677971, KJ677972, KJ677973, KJ677974 ve KJ677975) veritabanına eklendi. Çalışmada kullanılan siRNA molekülleri bu dizilim bilgilerine göre biyoinformatik araçlarla tasarlandı. Kuramsal olarak belirlenen 60 ekzonik siRNA molekülü arasından tri4 için dört (Tri4E1:5'-ACAATACGGGCGTGAGTCATGTCAA-3', Tri4E2:5'-GAACCCTGAGAGAAGTTGGTGATGT-3', Tri4E3:5'-ACATGCTCCTTGTACTTCAAGTTCT-3', Tri4E4:5'-CATCTTGGAGATCTCCCAGAGAT-3'), tri5 için ise iki siRNA (Tri5E1:5'-AAGCGACTACAGGCTTCCCTCCAAA-3', Tri5E2:5'-CAGGATCTGATGACTACCCTCAATT-3') gen susturma çalışmalarında kullanılmak üzere seçildi. Bu altı çift iplikli siRNA, protoplast kültürlerine tekli ve çoklu olmak üzere tri4 için 30, tri5 için de altı farklı kombinasyonda yardımcı plazmidler (pEGFP75 ve pAN7-1) ile birlikte transfekte edildi. Transfeksiyon etkinliği 36 deneme grubunda 500.00 ile 99.3310.06/5x104 arasında bulundu. Transfektantlar fluoresan mikroskopisi ve spektrofluorimetrik analizle seçildi. Hücrelerde GFP proteininin yayımlandığı fluoresan ışıma spektrofluorimetrik olarak ölçüldü. Transfektantların RFU (relatif fluoresan ünitesi) değerleri 1.37±0.07-2.89±0.06 arasında bulundu. Ayrıca pEGFP75 ve pAN7-1 plazmidlerinin aktarıldığı transfektantların seçiminde PZR da kullanıldı. Bu amaçla pAN7-1 plazmidindeki hph ve pEGFP75 plazmidindeki GFP genlerinin 0.7 kb'lik parçası çoğaltıldı. 30 deneme setinde tri4 geninin %100'e yakın düzeylerde baskılandığı gerçek zamanlı PZR analizi ile gösterildi. Geriye kalan altı deneme grubunda her iki tür için tri5 gen anlatımındaki azalma %65-95 olarak belirlendi. Aynı zamanda, tri4 ve tri5 susturulmuş Fusarium örneklerinde trikotesen biyosentezinin son ürünü olan DON mikotoksininin üretilmediği de ince tabaka kromatografisi ile de gösterildi. Sonuç olarak bu çalışmada tri4 ve tri5 genlerinin trikotesen biyosentez yolağının susturulmasında kullanılabileceği gösterildi. Bununla birlikte tri4 geninin tri5'e göre RNAi için daha kullanışlı bir hedef olabileceği sonucuna varıldı. Fusarium türlerinde siRNA transfeksiyonunun sonucu olarak gözlenen tri4 ve tri5 gen anlatımındaki belirgin düşmenin post-transkripsiyonel düzeyde gerçekleştiği düşünülmektedir. Bu çalışma Fusarium türlerinde siRNA aracılı gen susturma ile ilişkili ilk rapor olması yanı sıra, bitki patojeni olan türler ile mücadelede uygulanabilecek model olması bakımından da büyük önem taşımaktadır.