Single cell molecular biology, a relatively new scientific branch, is promising to study unique questions and leading to novel applications in biology and medicine. Single cell studies have been challenged by difficulties in selection and isolation of appropriate cells, low amplification efficiencies, allele drop outs, PCR contaminations and inefficiency of conventional analysis strategies. This study has explored the possibilities of analyzing multiple genetic conditions particularly concerning the beta globin and the HLA regions in human embryos. The HLA genes, beta-globin gene, and the associated microsatellites have been amplified simultaneously by multiplex PCR. DNA sequencing has been optimized for high resolution genotyping. The real-time PCR and melting curve analysis have been adapted for the first time for rapid and reliable analysis of the HLA compatibility. Use of microsatellites of the extended HLA locus has enabled more accurate and efficient detection of the allele drop outs, contaminations and recombinations. Amplification and informative detection have been obtained for 1012 blastomeres out of 1180 human embryos used in this study, giving a detection rate of 86%. A total of 122 (13%) embryos were found unaffected from beta thalassemia and had identical genotype at ten HLA regions. Transfer of 94 embryos that have resulted into 16 pregnancies with 14 healthy offsprings indicates the feasibility of the single cell applications for preventive medical approaches. Microsatellite typing of the extended HLA locus has enabled to study the characteristics of the meiotic recombinations in human embryos. The recombination rate was determined as 0.44 cM/Mb, 2.1 fold less compared to the general genomic recombination rate of 0.92 cM/Mb. It was 3.83 fold higher in the maternal MHC regions compared to the paternal MHC regions. Upto 14 fold difference was observed among individuals. Breakpoints of recombinations in the class II region were clustered between the DRB1 and DPB1 genes covering the TAP1 and TAP2 genes.

Tek hücre moleküler biyolojisinin, tıpta ve biyolojide yeni uygulamalara yol açması beklenmektedir. Uygun hücrelerin seçimi ve elde edilmesindeki zorluklar, DNA'nın çoğaltılmasındaki yetersizlikler, alel okuyamama (ADO), polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) kirlenmeleri ve mevcut inceleme yöntemlerinin yetersizlikleri tek hücre çalışmalarını kısıtlamaktadır. Bu çalışmada, insan embriyolarında beta globin geni ve HLA bölgelerinin incelenmesi hedeflenmiştir. HLA genleri, beta globin geni ve ilişkili mikrosatelitleri kapsayan genetik bölgeler PZR ile aynı anda çoğaltılmıştır. Yüksek çözünürlük genotipleme için DNA dizi incelemesi yapılmıştır. Gerçek zamanlı PZR ve ergime eğrisi kullanılarak HLA doku uyumu ve tek hücrede beta-globin mutasyonları incelenmiştir. Genişletilmiş HLA lokusunda bulunan mikrosatelitler kullanılarak alel okuyamama, DNA kirlenmesi ve rekombinasyonlar daha doğru ve hızlı belirlenmiştir. Sonuç olarak 1180 insan embriyosunun 1012 tanesinde %86 başarı ile PZR yapılabilmiştir. Ayrıca 122 adet (%13) embriyonun Akdeniz anemisinden etkilenmediği ve HLA uyumlu olduğu saptanmıştır. Toplam 94 adet embriyo transferi sonrasında 16 adet gebelik elde edilerek 14 sağlıklı bebek doğmuştur. Bu sonuç, tek hücre uygulamalarının koruyucu tıp için uygulanabilir bir seçenek olduğu göstermektedir. Genişletilmiş HLA lokusunun mikrosatelit incelemesi, insan embriyolarında mayotik rekombinasyonların özelliklerinin değerlendirilmesine olanak sağlamıştır. Bu bölge için rekombinasyon oranı ortalama 0,44 cM/Mb saptanmış olup genel genomik orandan (0,92 cM/Mb) 2,1 kez daha azdır. Ayrıca, anneye ait MHC bölgelerinde babaya ait MHC bölgelerine oranla 3,83 kat daha fazla rekombinasyon saptanmıştır. Kişiler arasında rekombinasyon oranı 14 kata kadar değişim göstermiştir. HLA sınıf II bölgesindeki rekombinasyon kırılma noktalarının TAP1 ve TAP2 genlerini kapsayan DRB1 ve DPB1 genleri arasında kümelendiği gösterilmiştir.