Heterotrimeric G-proteins mediate transmission of signals from G-protein coupled receptors to cell interior and activate signaling pathways in several organisms from yeast to mammals and plants. The heterotrimer consists of the alpha (Gα), beta (Gβ) and gamma (Gγ) subunits; Gαhas GTP binding and hydrolysis activity and Gα and Gβ/Gγ dimeric complex interact with downstream effectors upon activation. G-protein subunits have been identified in several plant species and were shown to be involved in growth and in responses to light and environmental stress factors including draught and pathogens [1]. Although the crystal structure data at 2.34 Å resolution is available for A. Thaliana Gα [2] but direct structural data on the Gβ/Gγ dimer and the heterotrimer as a whole are lacking in the literature. The mechanism of activation for the plant heterotrimer is generally inferred by assuming analogy with the mammalian complex. However, recent studies indicate that the plant α subunit may possess a self activation mechanism not observed in the mammalian system which sets a limit to the extent of the analogy [3]. Previously in our group we cloned and expressed Arabidopsis thaliana α subunit (GPA1) using Pichia Pastoris and β (AGB1) andγ (AGG2) subunits using E. coli systems [4, 5] with the aim structure-function studies on the individual subunits and the reconstituted complex. However, since expression and purification of the recombinant protein from yeast are more time and resource consuming compared with E. coli, we investigated possibilities for cloning the GPA1 sequence using alternative methods. In this study, results of cloning of GPA1 using pETM41 and pQE80L vectors are given together with investigation of expression. In different E.coli host cells, after optimizing the GPA1 expression, recombinant GPA1 was purified and biochemically characterized. Preliminary structural characterization of E. Coli produced GPA1 was also conducted by circular dichroism spectropolarimetry and dynamic light scattering measurements. Results show that GPA1 can be expressed in the Rosetta strain of E.coli as a fusion with maltose binding protein (MBP) giving a yield of 1.2 mg of protein from 1 L of culture. However, during cleavage of MBP tag with tobacco etch virus (TEV) protease, precipitation results in the loss of more than 70% of the purified protein with the remaining part of GPA1 being aggregated. We suggest that the one possible cause of precipitation is the N-terminal flexible region of GPA1 consisting of 36 aminoacids which may disrupt the stability. Another possible reason is the lack of post-translational modifications in E.coli. We did not observe any aggregation in GPA1 samples produced in P.pastoris system. Structural characterization experiments showed that the secondary structure content of P.pastoris GPA1 is consistent with the crystal structure data of mammalian GPA1. Further experiments are required to both improve the purification results to produce more GPA1 and for structural characterization of the protein.

Heterotrimerik G proteinleri, G-protein eşli reseptörlerden (GPCR) hücre içerisine sinyal iletimine aracılık eder ve maya, memeli ve bitki gibi birçok sistemde bulunan sinyal iletim yollarını aktifleştirir. Heterotrimer, alfa (Gα), beta (Gβ) ve gama (Gγ) olmak üzere üç altbirimden oluşur; Gα GTP bağlanma ve hidroliz aktivitesine sahiptir, GTP bağlanmasının üzerine Gα ve Gβ/Gγ dimer kompleksi aşağı yönde, hücre içine doğru efektör moleküllerle etkileşim içine girer. G- protein altbirimleri birçok bitki türünde tanımlanmış ve kuraklık, patojenler gibi çevresel stres faktörleri ve büyüme ile ilişkili olduğu gösterilmiştir [1]. A. Thaliana Gα için 2.34 Ao 'luk kristal yapı datası olmasına rağmen [2], Gβ/Gγ dimerin ve heterotrimerin bir bütün olarak yapısal dataları literatürde eksiktir. Bitki heterotrimeri için aktivasyon mekanizması, genel olarak genetik sekanstaki korunmuş bölgeler sebebiyle memeli kompleksiyle analoji oluşturarak yorumlanır. Buna rağmen, yakın zamanda yapılan çalışmalar bitki α altbiriminin kendine özgü, memeli sisteminde görülmeyen türde ve analojiyi limitleyen bir aktivasyon mekanizması olabileceği yönünde ipuçlarını göstermektedir [3]. Daha önce, Arabidopsis thaliana α altyapısı (GPA1), Pichia Pastoris kullanılarak, β (AGB1) ve γ (AGG2) altyapısı ise E. coli sistemleri kullanılarak klonlanmış ve ekspresyonları, her bir altbirimin ve bir araya getirilmiş kompleksin yapı-fonksiyon ilişkisi hedeflenerek gerçekleştirilmiştir [4, 5]. Buna rağmen, ekspresyon ve saflaştırma işlemi maya sistemi kullanıldığında, bakteri sistemine kıyasla çok daha fazla zaman ve kaynak kullanımına sebep olduğundan, GPA1'ın maya dışında alternatif methodlar kullanılarak klonlanması ve ekspresyonunu araştırılmıştır. Bu çalışmada, GPA1'ın pETM41 ve pQE80L vektörleri kullanılarak gerçekleştirilen klonlama sonuçları, bu vektörler kullanılarak elde edilen ekspresyon sonuçlarıyla birlikte verilmiştir. Farklı E.coli konak hücrelerinde GPA1 ekspresyonunun optimizasyonu yapıldıktan sonra, rekombinant GPA1 saflaştırılıp biyokimyasal analizleri yapıldı. E. coli ile üretilen GPA1'ın öncül yapısal karakterizasyonu `Circular Dichroism` ve `Dynamic Light Scattering` ölçüm methodları kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, GPA1 E. coli' nin Rosetta konak hücre çeşidi ile MBP' ye (Maltose Binding Protein) bağlı olarak 1L'lik kültürden 1.2 mg miktarında üretilebildiğini gösterdi. Buna rağmen, MBP işaretinin Tobacco Etch Virus (TEV) proteazı ile kesilmesi, GPA1'ın yaklaşık %70'lik kısmını çökmesi, kalan kısmının da kümeleşmesiyle sonuçlandı. Çökmenin muhtemel sebebinin, GPA1'ın N-bitiş kısmındaki 36 aminoasitlik esnek bölgesinin proteinin kararlılığına zarar vermesi olabileceğini düşünüyoruz. Bir başka muhtemel sebep ise E.coli'nin translasyon sonrasındaki modifikasyonları gerçekleştirememesi olabilir. Maya sistemi kullanılarak üretilen GPA1 örneklerinde herhangi bir kümeleşmeye rastlanmadı. Bununla birlikte, yapısal karakterizasyon deneyleri maya kullanılarak üretilen GPA1 örneklerinin, GPA'ın kristal yapı datalarıyla tutarlı olduğunu gösterdi. Hem saflaştırma deneylerini geliştirmek için hem de üretilen GPA1 miktarını yapısal karakterizasyon deneylerinde kullanmak adına arttırmak için daha fazla deney yapılması gerektiğine karar verildi.