Tez detayları

Rasyonel enzim tasarımı yoluyla neopullulanazın oksidatif ve termal stabilitesinin arttırılması = Increasing the oxidative and thermal stability of neopullulanase by rational enzyme design

Yazarlar:

Ece, Selin

Yayıncı:

Ege Üniversitesi

Ana Başlıklar:

Biyokimya

Belge Tipi:

Tezler

Program Tipi:

Yüksek Lisans

Yayın Tarihi:

12/2012

Belge Dili:

Türkçe

Document ID (Org No.):

2000260505

Anahtar sözcükler:

Biyokimya

Özet

Neopullulanase (E.C. 3.2.1.135) from Bacillus stearothermophilus catalyzes both the hydrolysis of ?-1,4 and ?-1,6 glycosidic linkages and ?-1,4 and ?-1,6 transglycosylation reactions. Despite neopullulanase is a potentially valuable enzyme for starch and detergent industries, it can not activate efficiently in the presence of oxidatives and at the temperatures over 60 °C.In this work, we aimed to increase the thermal and oxidative stability of neopullulanase by means of rational enzyme design. Certain aminoacid residues which are located in the surface cavities were exchanged with the aminoacids that involves larger sidechains. In order to increase chemical stability, one methionine residue was mutated to alanine, which is not prone to oxidation. Wild-type neopullulanase and its variants were recombinantly expressed in E.coli cells and purified by metal chelate affinity chromatography. The catalytic parameters and stability profiles of mutant enzymes were compared with those of wild-type neopullulanase. The effects of aminoacid exchanges on the protein stability and seconder structure were investigated by differential scanning calorimetry and circular dichroism spectroscopy. It was concluded that Val533Leu and Ala416Ile exchanges resulted in enhanced thermal stability and Met475Ala exchange resulted in improved oxidative stability.

Bacillus stearothermophilus kaynaklı neopullulanaz (E.C. 3.2.1.135), ?-1,4 ve ?-1,6-glikozidik bağların hidrolizi veya ?-1,4 ve ?-1,6-glikozidik bağların oluşturulduğu transglikozilasyon reaksiyonlarını katalizleyebilen bir enzimdir. Nişasta ve deterjan endüstrilerinde yüksek kullanım potansiyeline sahip bir enzim olmasına rağmen, 60ºC?den yüksek sıcaklıklarda ve oksidatif kimyasalların varlığında yüksek aktiviteye sahip değildir. Bu çalışmada, neopullulanazın termal ve kimyasal kararlılığının rasyonel enzim dizaynı yoluyla arttırılması amaçlandı. Bölge-yönlendirilmiş mutajenez kullanılarak, enzim yüzeyindeki oyuklara hacimli yan gruplara sahip amino asitler yerleştirildi. Kimyasal kararlılığın arttırılması amacı ile metiyonin artığı oksidasyondan etkilenmeyen alanin ile değiştirildi. E.coli hücrelerinde rekombinant üretilen enzimler metal-şelat afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Mutant enzimlerin katalitik parametreleri ve kararlılık özellikleri doğal enzim ile karşılaştırıldı. Diferansiyel tarama kalorimetrisi ve sirküler dikroizm ölçümleri ile amino asit değişimlerinin protein kararlılığı ve sekonder yapı üzerindeki etkileri incelendi. Val533Leu ve Ala416Ile değişimlerinin termal kararlılık, Met475Ala değişiminin oksidatif kararlılık özelliklerini geliştirdiği belirlendi.

Tez detayları

Rasyonel enzim tasarımı yoluyla neopullulanazın oksidatif ve termal stabilitesinin arttırılması = Increasing the oxidative and thermal stability of neopullulanase by rational enzyme design

Yazarlar: Ece, Selin

Yayıncı: Ege Üniversitesi

Ana Başlıklar: Biyokimya

Belge Tipi: Tezler

Program Tipi: Yüksek Lisans

Yayın Tarihi: 12/2012

Belge Dili: Türkçe

Document ID (Org No.): 2000260505