Recent studies showed that GPCRs on the cell surface can exist as homo- or hetoro dimers and/or oligomers. To date, several G-protein coupled receptors have been revealed to interact either with other G-protein coupled receptors or other membrane proteins, including ion channels. Adenosine A2A-Dopamine D2 and Dopamine D1-NMDA interactions are examples for well-studied heterodimerizations. All these receptors have critical functions in physiological processes. Adenosine A2A receptor modulates neurotransmission, cardiovascular system and immune response; while Dopamine D2 receptor controls the regulation of locomotion, food intake, learning, emotion and behavior. On the other hand, NMDAR mediates several signaling pathways necessary for synaptic plasticity, synaptic efficacy, neuronal morphology and memory formation by inducing long term potentiation. Dysfunctions in signaling mediated through these receptors have been shown in many neurological disorders, including Parkinson's disease, schizophrenia and Alzheimer's disease.The purpose of this study is detection of physical interactions between A2AR, D2R and NMDARs using fluorescent based detection methods, specifically Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assays. For this purpose, receptors were labelled with split-EGFP fragments, and full length EGFP and mCherry proteins from their C-tail; and by co-transfecting the labelled receptors to N2a cells with various combinations, homo- and heterodimerizations were analyzed with and without agonist treatment using laser scanning confocal microscope. Finally, the observed dimerizations were quantified using PixFRET, an imageJ plugin.Moreover, further studies are planned to study oligomerization of these three receptors by combining BiFC and FRET techniques. Establishing this model will facilitate to understand the molecular mechanisms of these receptor interactions; and understanding these interactions in detail could help us design new treatment options. Additionally, the fluorescence based live cell model will be used to detect possible effects of potential drug candidates on the interactions of these receptors.

Güncel çalışmalar, G-proteine kenetli reseptörlerin (GPKR) hücre zarı üzerinde homo- veya heterodimerler halinde bulunduğunu göstermiştir. Bugüne kadar, birçok GPKR'nin diğer GPKR'ler ile veya iyon kanalı gibi diğer membran proteinleri ile eşleştiği gösterilmiştir. Adenozin A2A - Dopamin D2 ve Dopamin D1 - NMDA etkileşimleri iyi çalışılmış GPKR heterodimerizasyon çalışmalarına örnektir. Bu üç reseptör de fizyolojik fonksiyonlarda kritik rollere sahiptir. Adenozin A2A reseptörü sinirsel iletim, kardiyovasküler sistem ve bağışıklık sisteminde önemli roller oynarken, Dopamin D2 reseptörü hareket yeteneği, besin alımı, öğrenme, duygu ve davranış gibi fonksiyonların düzenlenmesini kontrol etmektedir. Diğer yandan, NMDA reseptörleri uzun süreli potansiyel artışı sağlayarak sinaptik pilastisite, sinaptik etkinlik, nöronal morfoloji ve hafıza oluşumu gibi önemli fonksiyonları düzenlemekte görev alır. Bu reseptörlerce yönetilen sinyalizasyonlardaki fonksiyon bozukluklarının Parkinson, şizofreni ve Alzheimer hastalıkları gibi birçok nörolojik rahatsızlıklar ile alakası olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir.Bu çalışma, A2A, D2 ve NMDA reseptörleri arasındaki fiziksel etkileşimlerin, Bimoleküler Floresan Tamamlama ve Floresan Rezonans Enerji Transferi gibi floresan-temelli yöntemlerle tespit edilmesini amaçlamaktadır. Bu amaçla, hedef reseptörler bölünmüş-EGFP parçaları ve tüm EGFP ve mCherry floresan proteinleri ile işaretlenmiş ve işaretlenen reseptörler farklı kombinasyonlar ile N2a hücre hattında gözlemlenmiştir. Homo- ve heterodimerizasyon oluşumları agonistsiz ve agonistli koşullarda lazer taramalı konfokal mikroskop yardımı ile analiz edilmiştir. Tespit edilen dimerizasyonlar bir imageJ eklentisi olan PixFRET programı sayesinde niceliksel olarak belirlenmiştir.Ayrıca, BiFC ve FRET tekniklerinin kombine edilmesi ile bu reseptörler arasındaki olası oligomer oluşumlarının çalışılması, bu çalışmanın devamı olarak planlanmıştır. Böyle bir modelin kurulması, bu reseptörler arasındaki etkileşimin moleküler mekanizmalarını anlamayı kolaylaştıracak ve bu mekanizmalar yeni tedavi opsiyonlarının tasarımı için kullanılabilecektir. Üstelik canlı hücrelerde kullanılabilen bu floresan tabanlı model, potansiyel ilaç adaylarının etkileşimler üzerindeki olası etkilerinin araştırılmasında kullanılabilecektir.