Cellular senescence is a tumor-suppression mechanism, and immortalizationfacilitates neoplastic transformation. Both mechanisms may be highly relevantto hepatocellular carcinoma (HCC) development. We worked on two ma jor as-pects of cellular senescence and immortality in HCC. First, we analyzed the roleof ZEB2 (Smad-interacting protein SIP1, ZFXH1) gene for a senescence-relatedrole in HCC. Then, we extended our work on the identi ? cation and analysis ofa senescence and immortality gene network (SIGN) in relation to hepatocellularcarcinogenesis. ZEB2 is a transcriptional repressor of E-cadherin, and inducesepithelial-mesenchymal transition (EMT), a key process involved in tumor metas-tasis and progression. However, ZEB2 is also a repressor of telomerase reversetranscriptase (TERT) gene, which encodes a key enzyme required for telomeremaintenance and tumor cell immortality. We performed in-vivo, in-silico andin-vitro studies to explore potential implications of ZEB2 in hepatocellular carci-noma (HCC). Tissue expression of ZEB2 transcripts displayed stepwise decreasesin HCC lesions, as compared to liver cirrhosis. This inverse correlation suggestedthat sustained ZEB2 expression is not compatible with HCC progression. Next,we studied in vitro e ? ects of ZEB2 knockdown and overexpression in HCC cells.Huh7 clones stably transfected with a speci ? c ZEB2-shRNA expression vectordisplayed increased colony formation and increased proliferation. Conversely,Hep3B cells stably transfected with ZEB2 expression vector displayed permanentcell cycle arrest associated with increased senescence-associated ß -galactosidaseactivity. ZEB2-induced senescence arrest was correlated with the repression ofTERT expression and concomitant upregulation of cyclin-dependent kinase in-hibitor p21Cip1 . Transient expression of ZEB2 did not induce p21Cip1 expression,suggesting an indirect mechanism. Finally, ZEB2 overexpression was not com-patible with in vitro survival of cancer cells, as ZEB2-overexpressing Hep3B andA431 clones depleted progressively during in vitro culture and expansion. Theseobservations suggest that the ZEB2 gene, aside from its role in EMT, also playsa negative role in HCC cell growth and survival.In the other study, we integrated gene expression data from senescence pro-grammed and immortal HCC cells with the data from cirrhosis and HCC tissuesto generate a SIGN signature. The SIGN signature accurately classi ? ed nor-mal liver, cirrhosis, dysplasia and HCC lesions, and indicated that senescence-to-immortality conversion ? rst occured during dysplasia-to-early HCC transi-tion. Senescence-to-immortality conversion contributed also to tumor progres-sion. This conversion was accompanied by hepatic dedi ? erentiation and increasedexpression of cell proliferation, chromosome modi ? cation and DNA damage re-sponse genes. Thus, HCC immortalization is closely associated with the ac-quisition of stem/progenitor-like features. Finally, we identi ? ed a large set ofupregulated DNA damage checkpoint and DNA repair genes that showed signif-icant associations with tumor initiation and progression. These genes may serveas potential targets for HCC prevention and therapy.

Hücre yaşlanması tümör baskılayıcı bir mekanizmadır ve ölümsüzlük, neoplas-tik dönüşümü kolaylaştırır. Her iki mekanizma da hepatoselüler karsinom (HCC)gelişimi ile yakından ilişkilidir. Biz, HCC'de hücre yaşlanması ve ölümsüzlügünüiki açıdan çalıştık. Önce, ZEB2 (Smad ile etkileşen protein SIP1, ZFHX1B)geninin HCC'deki yaşlanma ile ilişkili rolünü inceledik. Sonra, çalışmamızı, hep-atoselüler kanser ile ilişkili yaşlanma ve ölümsüzlük gen ağı (SIGN)'nın belirlen-mesi ve analizi yönünde genişlettik. ZEB2, E-kaderin'i baskılar ve tümör metas-tazında ve gelişiminde anahtar rol oynayan, epitel-mezenkimal geçiş (EMT)'yi,indükler. Öte yandan ZEB2, telomer muhafazası ve tümör hücre ölümsüzlügüiçin gerekli enzim, telomeraz ters transkriptaz (TERT)'ı baskılar. Biz, ZEB2'ninhepatoselüler kanserdeki potansiyel anlamını keşfetmek için, in-vivo, in-vitrove in-silico çalıştık. ZEB2 transkriptlerinin doku ifadeleri, HCC lezyonlarında,karaciğer sirozuna kıyasla dereceli olarak azalma gösterdi. Bu ters bağıntı, ZEB2ifadesinin, HCC'nin ilerlemesiyle uyumlu olmadığını akla getirdi. Sonra, HCChücrelerinde ZEB2'nin azaltılması ve artırılmasının in vitro etkilerini çalıştık.Özgün bir ZEB2-shRNA ifade vektörü ile kararlı şekilde transfekte edilen Huh7klonları, koloni oluşumunda ve çoğalmada artış gösterdiler. Karşıt şekilde, ZEB2ifade vektörü ile transfekte edilen Hep3B hücrelerinin, yaşlanma ilişkili ß -galaktozidazaktivitesi ile, kalıcı hücre döngüsü hapsine girdiklerini gördük. ZEB2 ile indüklenenyaşlanma hapsi, TERT ifadesinin baskılanması ve eşlik eden siklin-bağımlı kinazengelleyici p21Cip1'in ifadesindeki artış ile bağıntılı idi. ZEB2'nin geçici ifadesi,p21Cip1 ifadesindeki artışı indüklemedi. Son olarak, ZEB2'yi aşırı ifade edenHep3B ve A431 klonlarının, in-vitro kültürde dereceli olarak azalması ile ZEB2aşırı ifadesinin, kanser hücrelerinin in-vitro yaşamı ile uyumlu olmadığı sonucunavarıldı. Bu gözlemler, ZEB2 geninin, EMT'deki rolünün dışında, HCC hücrebüyümesi ve yaşamasında negatif rol oynadığını düşündürdü.Diğer çalışmamızda SIGN imzasını oluşturmak için, yaşlanmaya program-lanmış ve ölümsüz HCC hücrelerinden gelen gen ifade datasını, siroz ve HCCdokularından gelen data ile birleştirdik. SIGN imzası normal karaciğer, siroz, dis-plazi ve HCC lezyonlarını doğrulukla sını ? andırdı ve yaşlanmadan ölümsüzlüğedönüşümün, ilk olarak displaziden erken HCC'ye geçişte gerçekleştiğini belirledi.Bu dönüşüm, tümör ilerlemesine de katkıda bulunur. Yaşlanmadan ölümsüzlüğedönüşüme, hepatik geri başkalaşım ile ve hücre çoğalması, kromozom değişimi veDNA hasar yanıtı genlerindeki ifade artışı eşlik etti. Bu nedenle, HCC ölümsüzlüğü,kök hücre/öncü hücre benzeri özellikler ile yakından ilişkilidir. Son olarak, DNAhasar kontrol noktası ve DNA tamir genlerindeki artış ile, tümör başlangıcı veilerlemesi arasında ilişki bulduk. Bu genler, HCC'nin engellenmesinde ve ter-apisinde potansiyel hede ? er olabilirler.