Terpenoids constitute the most diverse family of natural products. They are involved in several biological functions and are used in medical and industrial applications. The key to their diverse biological activities is their structural diversity. Terpenoids are synthesized in three stages, all of which contribute to generation of structural diversity. In the terpenoid biosynthetic pathways, terpene synthases generate larger linear terpenoid precursors from smaller units via condensation reactions, terpene cyclases transform precursors via cyclization reactions, and then tailoring enzymes modify terpenoid products via addition of functional groups. Recently discovered geranyl diphosphate C-methyltransferase (GPPMT) from Streptomyces coelicolor A3(2) is able to modify a linear monoterpenoid precursor, geranyl diphoshate (GPP), to produce a non-canonical terpenoid precursor, 2-methylgeranyl diphosphate. Modification of GPP by GPPMT is the first example of modification of a canonical linear isoprenoid precursor in nature. This study aims to achieve enzymatic synthesis of novel methylated non-canonical diterpenoid precursors, such as 2-methylgeranylgeranyl diphosphate (2MGGPP) by engineering GPPMT. The novel non-canonical precursors may later be utilized by cyclases to enhance the diversity of the terpenome. For example, taxadiene synthase could utilize 2MGGPP to generate variants of taxadiene, the precursor of the leading anti-cancer drug paclitaxel (Taxol®). Candidate mutants predicted to use GGPP as substrate were selected via in silico analysis of GPPMT structure. These mutations were introduced using the Quick-change site-directed mutagenesis. Mutant genes were expressed in E.coli strains. Mutant proteins were purified by Fast Protein Liquid Chromatography. Catalytic activities of mutants against canonical terpenoid precursors were determined by SAM methyltransferase assay.

İzoprenoidler yada terpenler olarak da bilinen terpenoidler, doğal ürünlerin en çeşitli ailesini oluştururlar. Birçok biyolojik işlevlere sahiptirler ve çeşitli endüstride ve tıpta kullanılırlar. Terpenoidlerin çeşitli biyolojik aktiviteleri yapısal çeşitliliklerinden kaynaklanır. Terpenoidler az sayıda öncülden üç safhada sentezlenirler, bu safhaların hepsi, yapısal çeşitliliğin oluşmasına katkıda bulunur. Terpenoid biyosentez yolaklarında, terpen sentaz enzimleri küçük birimlerden daha büyük doğrusal terpenoid öncüllerini kondensasyon tepkimeleri ile oluşturur, terpen siklaz enzimleri öncülleri halkalılaştırma tepkimeleri ile dönüştürür ve sonrasında ise rütuş enzimleri terpenoid ürünlere fonksiyonel gruplar ekleyerek modifiye eder. Son yıllarda keşfedilen Streptomyces coelicolor A3(2) kaynaklı geranil difosfat C-metiltransferaz (GPPMT) enziminin standart dışı olan 2-metilgeranil difosfatı (2MGPP) üretmek için standart bir doğrusal monoterpenoid olan geranil difosfatı (GPP) modifiye ettiği gösterilmiştir. GPP'nin GPPMT tarafından modifikasyonu, standart doğrusal izoterpenoid öncülünün modifikasyonun doğadaki ilk örneğidir. Bu çalışma GPPMT'nin değiştirilmesi ile 2-metilgeranilgeranil difosfat (2MGGPP) gibi diğer standart olmayan diterpenoidlerin enzimatik sentezini başarmayı amaçlamaktadır. Sonrasında, standart olmayan bu öncüller diterpen siklazlar tarafından terpenom (toplam terpen içeriği) çeşitliliğini artırmak için kullanılabilirler. Örneğin, taksadiyen sentaz yaygın bir kanser ilacı olan paklitaksel'in (Taksol®) öncülü olan taksadiyen'in değişik şekillerini üretmek için 2MGGPP'yi kullanabilirler. Substrat olarak GGPP'yi kullanacağı düşünülen aday GPPMT mutantları, GPPMT'nin yapısının bilgisayar ortamındaki analizleri ile seçildi. Bu mutasyonlar QuickChange bölgeye yönlendirilmiş mutasyon protokolü ile yapıldı. Mutant genler E.coli suşları kullanılarak ifade edildi. Proteinler hızlı protein sıvı kromatografisi ile saflaştırıldı. GPPMT mutantlarının terpenoid öncüllere karşı katalitik aktiviteleri SAM metiltransferaz yöntemi ile belirlendi.