Therapeutic peptides have become promising due to their high affinity and specificity to the target, deep tissue penetration, low toxicity, convenience for structural modifications, and cost effectiveness. For a lead molecule to reach the market, approximately a 15-year period and an investment of around 2.6 billion dollars are necessary. One of the most important parameters to evaluate the lead compounds in the process of Drug Discovery and Development is binding affinity, which is the strength of the non-covalent interactions between the ligand and the target molecules. This thesis study focuses on in silico design of peptides to block IL1β – Receptor instead of therapeutically used recombinant protein, Anakinra, which has the same structure as the human native IL1 – Receptor antagonist molecule. In order to verify the validity of the computationally designed peptides, surface plasmon resonance methods were used to measure the binding affinity of them. 9 different peptide sequences were designed from the three-dimensional structure of IL1-Receptor Antagonist protein by considering the type and number of non-covalent interactions that form with the receptor. In order to evaluate the binding affinities of these peptides, molecular docking simulations were performed for 100 runs by fixing the bonds. Peptide C, which is Arg – Ile – Trp – Asp – Val – Asn – Gln, showed the highest binding affinity with KD of 7.91x10-8 M. The docking studies were repeated to confirm the binding affinity of Peptide C without fixing the bonds for 999 runs. Since Peptide C is consistent in terms of its binding affinity to the receptor, N- terminus and C- terminus modifications were applied to increase the conformational stability of the peptide. N- terminus modification resulted as Phe insertion to the amino group of Peptide C, while C- terminus modification requires Lys insertion. The modifications increased the number of hydrophobic interactions while also keeping hydrogen bonds between the peptide and the receptor that both N- and C- termini modified peptide has KD of 0.24x10-9 M. To understand unbinding pathway and binding affinities of our designed peptides in a more accurate and realistic environment, SMD simulations were performed for unmodified sequence which is Peptide C, N- terminus modified 8- amino acid peptide, and both N- and C- termini modified 9- amino acid peptide. The binding affinity values for the three of the peptides from SMD simulations are consistent with the average values obtained from the docking. Since water molecules are present in SMD simulations, they interfere between the peptide and the receptor molecules that the distance between the interactions increase thereby, causing the loss of some of the hydrogen bonds and most of the hydrophobic interactions. Due to this fact and realistic aspect of SMD, three of the peptides show binding affinities to the receptor at the average values of the docking results. In Chapter 3, three of the peptides obtained as a result of the computational studies were synthesized using Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis methods. High Performance Liquid Chromatography was used to analyze the synthesis. Even though, we showed that our first synthesis which is for the unmodified peptide was successful, due to a problem occurrence either in the column or in the instrument, after a while, we even could not obtain the chromatograms of the standard samples of the peptides. The chromatograms of the standard samples were obtained using a different instrument. However, due to TFA fragmentation of the peptides, our synthesis products might have corrupted that further studies continued with the custom synthesis peptides.Finally, to validate the binding affinity of the peptides experimentally, Surface Plasmon Resonance (SPR) method was used. In Biacore T200 instrument, CM5 sensor chip surface was immobilized with IL1-Receptor using amine coupling chemistry. To verify the accuracy of the instrument, binding affinity of IL1-β to IL1-Receptor was measured performing kinetics analysis. Concentration dependency was obtained and KD was found out as 2.8 nM which is a consistent result with the literature value, 2.7 nM. Although concentration dependency was also obtained for the peptides, binding affinity values could not be obtained yet due to the bulk effect of DMSO. The kinetics analysis to measure binding affinity of the peptides will be repeated by performing solvent correction prior to the analysis to prevent bulk effect of DMSO.

Terapötik peptitler yüksek bağlanma ve özgül bağ kurma yeteneleri, dokunun içerisine derinlemesine girebilme, düşük toksisite ve yapısal modifikasyonlarının kolay olması özelliklerinden dolayı ilaç tasarımı için gelecek vaat eden moleküller olmuşlardır. Bir ilaç adayı molekülün pazara girebilmesi için yaklaşık 15 senelik bir araştırma ve geliştirme süreci ile birlikte 2.6 trilyon dolarlık yatırım gerekmektedir. İlaç Tasarımı ve Geliştirme sürecinde aday molekülün incelenmesi için gerekli en önemli parametrelerden birisi aday molekülün hedefe olan bağlanma derecesidir. Bağlanma derecesi, ligand ve hedef molekül arasındaki kovalent olmayan bağların güçlülük değeridir. Bu tez çalışmaları IL1β-Reseptör proteinini bloke etmek için terapötik olarak kullanılan, insanda doğal olarak bulunan IL1-Reseptör antagonist molekülü ile aynı yapıya sahip ve bir rekombinant protein olan Anakinra yerine bilgisayar ortamında peptit tasarımına odaklanmıştır. Bilgisayar ortamında hesaplamalı olarak tasarımı yaılan peptitlerin geçerliliğini göstermek amacıyla da bağlanma derecesini ölçebilecek bir metot olan yüzey plazmon rezonans deneyleri yapılmıştır. IL1-Reseptör proteininin üç boyutlu yapısı incelenerek ve kovalent olmayan bağların türü ve sayısı dikkate alınarak bu yapıdan 9 farklı peptit dizilimi tasarlanmıştır. Bu peptitlerin bağlanma derecelerini inceleyebilmek için moleküler seviyede yerleştirme (docking) çalışmaları her bir peptit için aralarındaki bağları sabit tutarak 100 kez yapılmıştır. Arg – Ile – Trp – Asp – Val – Asn – Gln dizilimine sahip Peptit C, 7.91x10-8 M değerindeki KD değeri ile tasarlanan peptitler arasında en yüksek bağlanma derecesini göstermiştir. Peptit C'nin yüksek bağlanma derecesine sahip olduğunu teyit etmek için docking çalışmaları peptidin bağlarını sabitlemeden 999 defa yapılmış ve benzer sonuç elde edilmiştir. Peptit C'nin bağlanma derecesinin yüksekliğinin tutarlılığını gösterdikten sonra yapısal kararlılığını arttırmak amacıyla peptidin amino ve karboksil grup uçlarına modifikasyon yapılması amaçlanmıştır. N- terminal modifikasyonu Phe eklenmesi sonucunu verirken C- terminal modifikasyonu da karboksil grubu ucuna Lys aminoasidi eklenmesi sonucunu vermiştir. Bu modifikasyonlar peptit ve reseptör arasındaki hidrojen bağlarını tutarak aradaki hidrofobik etkileşimleri arttırmış ve hem N- hem de C- terminalleri modifiye olmuş 9 aminoasitli peptit 0.24x10-9 M KD değeri sonucunu vermiştir. Tasarlanan peptitlerin kopma yolunu anlamak ve bağlanma derecelerini daha doğru ve gerçekçi bir ortamda incelemek amacıyla SMD simülasyonları üç peptit için de yapılmıştır. SMD sonuçlarına göre üç peptit için de bağlanma dereceleri docking çalışmalarından alınan ortalama değerlerle tutarlılık göstermektedir. SMD simülasyonlarında ortamda su bulunduğu için peptit ve reseptör moleküllerinin arasına su molekülleri girerek etkileşimler ve bağlar arasındaki mesafelerin artmasına ve bu da bazı hidrojen bağlarının ve çoğu hidrofobik etkileşimlerin kaybolmasına neden olmaktadır. Bu nedenlerden dolayı da peptitler, docking çalışmalarından alınan en iyi sonuçlar yerine ortalama değerlere yakın bağlanma dereceleri göstermektedir. Tezin 3. bölümünde bilgisayar ortamında hesaplamalı olarak tasarlanan peptitler Fmoc kimyasının kullanıldığı Katı Hal Peptit Sentezi metoduyla sentezlenmişlerdir. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi metodu da yapılan sentezi incelemek için kullanılmıştır. Modifiye olmamış peptit ilk sentezimiz olmuş olup o sentezin başarılı olduğunu göstermemize rağmen kromatografi kolonunda veya cihazın kendisinde daha sonradan oluşan bir problemden dolayı peptitlere ait standard örenklerin dahi kromatogramları elde edilememiştir. Daha sonra standard örneklerin kromatogramları başka bir cihazda aynı metodu kullanarak elde edilmiştir. Ancak TFA'nın peptidi parçalara ayırma özelliğinden dolayı bu bekleme sürecinde peptitler bozulmaya uğramış olabilir ve gelecek çalışmalara standard olarak kullandığımız peptitlerle devam edilmiştir. Son olarak, deneysel olarak peptitlerin bağlanma derecelerini ölçmek amacıyla Yüzey Plazmon Rezonans metodu kullanıldı. Biacore T200 cihazında CM5 sensör çipine amin birleştirme kimyası yoluyla IL1-Reseptör proteini yerleştirildi. Cihazın doğru çalıştığından emin olmak için IL1-β proteininin IL1-Reseptör Proteinine olan bağlanma derecesi ölçüldü ve KD değeri 2.8 nM olarak elde edildi. Literatürde de bu değerin 2.7 nM olarak elde edildiği gösterilmiştir. Peptitler için de konsantrasyona bağlılık elde edilmiş olsa da DMSO'nun hacim etkisinden dolayı bağlanma dereceleri ölçülememiştir. Peptitlerin bağlanma derecelerini ölçmek için yapılacak olan kinetik analiz deneyleri DMSO'nun hacim etkisini engellemek için çözücü doğrulama metodu kullanarak tekrar edilecektir.