Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is an embryonic program that is reactivated in cancer and regulates the invasion and metastasis of tumor cells. ZEB2 is one of the transcription factors that induce EMT. Our research through Competing Endogenous RNA Database (ceRDB) revealed that ETS1 is a ZEB2 ceRNA, and we found that ETS1 is co-expressed with ZEB2 in hepatocellular carcinoma (HCC) cells. These findings stimulated us to investigate in HCC and ZEB2-inducible cell lines whether ZEB2 transcription factor regulates ETS1 at promoter and ceRNA levels. Chromatin immunoprecipitation and luciferase reporter assays clearly showed that ZEB2 binds to E-box sequences on the promoter of ETS1. Elevated expression of ETS1 was found in DLD-ZEB2 and A431-ZEB2 inducible systems, and knockdown of ZEB2 caused an explicit downregulation of ETS1 in shZEB2-SNU398 and shZEB2-SK-HEP-1 cells. Repression of ETS1 expression in ZEB2-induced conditions substantially impaired the migration and invasive capacities of DLD1 cells. Mechanistically, knockdown of ETS1 in ZEB2-expressing cells resulted in the downregulation of established ZEB2 targets TWIST1 and MMP9. To investigate the ceRNA interactions between ZEB2 and ETS1, we measured the luciferase activity of shETS1-SK-HEP-1 cells transfected with ZEB2 3'-UTR reporter vector. The decrease in luciferase activity upon repression of ETS1 indicated ceRNA-mediated regulation of ZEB2 by ETS1. Correlation analyses in hepatocellular carcinoma cell lines, cancer cDNA arrays and TCGA RNA-sequencing dataset revealed that ZEB2 and ETS1 are co-expressed, and their expressions in human tumors show a highly significant positive correlation. Our results demonstrated that ZEB2 acts as an upstream regulator of ETS1 and, in turn, ETS1 maintains ZEB2-induced EMT. These findings add another level of complexity to the understanding of ZEB2 in the invasion and metastasis of cancer cells, and put ZEB2/ETS1 axis as a novel therapeutic target in human malignancies.

Epitelyal-mezenkimal geçiş, kanserde yeniden aktive olan ve tümör hücrelerinin istila ve metastazını düzenleyen embriyonik bir programdır. ZEB2, EMT'i indükleyen transkripsiyon faktörlerinden biridir. Yarışmacı endojen mRNA veritabanına (ceRDB) göre ETS1'in ZEB2'nin ceRNA'sı olabileceğini ve ETS1'in hepatoselüler karsinoma hücrelerinde ZEB2 ile birlikte ifade edildiğini bulduk. Bu bulgular, hepatoselüler karsinoma (HCC) ve ZEB2 ile indüklenebilir hücre hatlarında, ZEB2 transkripsiyon faktörünün, promotor ve ceRNA seviyelerinde ETS1'i düzenleyip düzenlemediğini araştırmaya teşvik etti. Kromatin immünopresipitasyon ve lusiferaz raportör deneyleri, ZEB2'nin ETS1 promotorundaki E-box sekanslarına bağlandığını açıkça gösterdi. ZEB2 ifadesi indüklenebilen DLD-ZEB2 ve A431-ZEB2 hücrelerinde ETS1'in yüksek oranda ifade edildiği ve ZEB2'nin baskılandığı shZEB2-SNU398 ve shZEB2-SK-HEP-1 hücrelerinde ETS1 ifadesinin belirgin bir şekilde azaldığı bulundu. ZEB2'nin indüklendiği koşullarda ETS1 ifadesinin baskılanması DLD1 hücrelerinin göçünü ve istilacı kapasitelerini önemli ölçüde bozmuştur. ZEB2 ifade eden hücrelerde ETS1'in baskılanması, mekanik olarak ZEB2 hedefleri olan TWIST1 ve MMP9 ifadelerinin azalmasıyla sonuçlandı. ZEB2 ve ETS1 arasındaki ceRNA ilişkisini aydınlatmak amacıyla ETS1 ifadesi baskılanan SK-HEP-1 shETS1 hücresinde ZEB2 3'UTR lusiferaz aktivitesini ölçtük. ETS1 ifadesi baskılanan hücrede ZEB2 3'UTR lusiferaz aktivitesinde azalma, iki gen arasındaki ceRNA ilişkisini ortaya koymaktadır. Hepatoselüler karsinoma hücre hatları, kanser cDNA dizinleri ve TCGA RNA dizileme veri setindeki korelasyon analizleri, ZEB2 ve ETS1'in birlikte ifade edildiğini ve bunların insan tümörlerindeki ifadelerinin oldukça anlamlı bir pozitif korelasyon gösterdiğini ortaya koydu. Sonuçlarımız, ZEB2'nin ETS1'in düzenleyicisi olarak görev yaptığını ve ETS1'in ZEB2 kaynaklı EMT'nin düzenlenmesinde rol oynadığını gösterdi. Bu bulgular, kanser hücrelerinin istila ve metastazlarında ZEB2'nin rolünün anlaşılmasına başka bir karmaşıklık düzeyi eklemekte ve ZEB2 / ETS1 eksenini, insan malignitelerinde yeni bir terapötik hedef olarak ortaya koymaktadır.