Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR/Cas9, which was originally characterized as an adaptive immune system in bacteria, has become the most powerful genome engineering technology in recent years and it can be used as a genome engineering and knockout technology due to its ease of use and flexibility. CRISPR/Cas9 can also be turned into a powerful gene expression manipulation tool by conversion of Cas9 endonuclease into a catalytically inactive form called dead-Cas9 (dCas9). When dCas9 is fused with transcriptional repressor or activator domains, it is able to supress or activate the target gene expression, respectively with the design of proper target sites and guide RNAs (sgRNA).In this study, we aimed to set up CRISPR based knockout, inhibition (CRISPRi) and activation (CRISPRa) systems and implement them in melanoma cells to characterize the role of Interferon Regulatory Factor 4 (IRF4) in in vitro assays that interrogate cancer- related phenotypes. In this study, we successfully set up lentiviral and inducible CRISPR based knockout, knockdown (CRISPRi) and activation (CRISPRa) methods, which were used to manipulate IRF4 expression in melanoma cell lines. After validation of these systems, we used them in GFP competition assays. According to our preliminary data, IRF4 is important for the competitive fitness and/or survival of melanoma cells, which is in line with a model where melanoma cells have non-oncogene addiction to IRF4 expression, similar to several B-cell origin cancers.

Bakterilerde daha önceleri bir uyarlayıcı bağışıklık mekanizması olarak keşfedilen ve `Düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik kümeler` anlamına gelen CRISPR/Cas9 sistemi kullanım kolaylığı ve kolay uyarlanabilme özelliğinden dolayı son yıllarda yaygınlaşan bir genom mühendisliği ve gen nakavt teknolojisi haline gelmiştir. CRISPR/Cas9, Cas9 endonükleazının mutasyona uğratılıp dCas9 olarak adlandırılan katalitik olarak inaktif hale getirilmesiyle çok etkili bir gen ifadesi manipülasyon aracı olarak kullanılabilir. dCas9 proteini transkripsiyon baskılayıcı veya aktive edici protein bölgeleriyle birleştirilince hedef genlerin ifade edilmesini daha güçlü bir şekilde baskılayabilir veya ifade edilmesini aktif hale getirebilir. Genom üzerindeki hedef bölgelerin ve rehber RNA'ların düzgün dizayn edilmesiyle çok yüksek seviyede gen ifadesi baskılama ya da aktive etme seviyelerine ulaşılabilir.Bu çalışmada CRISPR temelli gen nakavtı, gen ifadesi baskılama ve aktive etme yöntemlerini melanoma hücreleri üzerinde uygulayarak Interferon Düzenleyici Faktör 4'ün (IRF4) bu hücrelerdeki rolünü kanser fenotiplerini araştıran deneylerle karakterize etmeyi amaçladık. Sonuçlarımıza göre, CRISPR temelli, lentiviral ve uyarılabilir gen nakavtı, gen ifadesi baskılama ve aktive etme metotlarını başarıyla dizayn ederek uyguladık ve daha sonra bu sistemleri IRF4'ün ifadesini melanoma hücrelerinde manipule etmek için kullandık. Bu sistemleri valide edilmelerinden sonra GFP hücre yarıştırma deneylerinde kullandık. GFP hücre yarıştırma deneylerinin ön sonuçlarına göre IRF4'ün melanoma hücrelerinin rekabete dayanan sağlık durumları ve hayatta kalmaları için kritik olduğunu gözlemledik. Bu sonuçlar melanoma hücrelerinin de çeşitli B hücresi kanser hücrelerine benzer şekilde IRF4'e karşı onkogen olmayan bağımlılıklarının olduğunu göstermektedir.