ABSTRACTDEVELOPMENT OF LABEL FREE DETECTION METHODSFOR GENETICALLY MODIFIED ORGANISMSKARAMOLLAOĞLU, İremPhD., Department of Biological SciencesSupervisor: Prof. Dr. H. Avni ÖKTEMMarch 2007, 108 pagesA great effort has been recently devoted to the development of new devices for thedetection of specific sequences of DNA, due to increasing need of label - free, fast,cheap, and miniaturized analytical systems able to detect target sequences forscreening purposes, especially in food industry for genetically modified organisms(GMOs).In this study, development of a QCM - based DNA biosensor for the detection of thehybridisation of CaMV 35S promoter sequence (P35S) was investigated. Attentionwas focused on the choice of the coating chemistry that could be used for theimmobilisation of probe sequences on the gold surface of the quartz crystal. Twoimmobilisation procedures were tested and compared considering the amount of theimmobilised probe, the extent of the hybridisation reaction, the possibility ofregeneration and the absence of non - specific adsorption.ivThe two coating methods were based on the use of self - assembled monolayers. Oneof them employed the interaction between the thiol and gold for the immobilisationof a thiolated P35S probe, while the other employed formation of functionalisedaldehyde groups by ethylenediamine plasma polymerization on the gold surface forthe immobilisation of amined P35S probes through gluteraldehyde activation.Results indicated that immobilisation of a thiolated probe provides betterimmobilisation characteristic, higher sensitivity for the detection of the hybridisationreaction, absence of non - specific adsorption and a higher stability with respect tothe regeneration step.The optimised immobilisation procedure for the thiolated probe was used for thedetection of P35S sequence in PCR - amplified DNAs and in real samples of pflp -gene inserted tobacco plants that produce ferrodoxin like protein additionally.Fragmentation of the genomic DNAs were achieved by digestion with restrictionendonucleases and sonication. The obtained results from the fragmented genomicDNAs demonstrated that it is possible to detect the target sequence directly in non-amplified genomic DNAs by using the developed QCM - based DNA biosensorsystem.The developed QCM-based DNA biosensor represented promising results for a real-time, label - free, direct detection of DNA samples for the screening of GMOs.Key words: DNA - based biosensors; Genetically Modified Organisms (GMOs);CaMV P35S; immobilisationv.

ÖZGENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ ORGANİZMALAR İÇİNİŞARETSİZ SAPTAMA METODLARININ GELİŞTİRİLMESİKARAMOLLAOĞLU, İremDoktora, Biyolojik Bilimler BölümüDanışman: Prof. Dr. H. Avni ÖKTEMMart 2007, 108 SayfaGıda sektöründe, özellikle genetiği değiştirilmiş organizmalarda (GDO) hedefbölgelerin taranmasını sağlayan hızlı, ucuz ve minyatürize edilmiş analitik sistemlereihtiyaç duyulmaktadır ve bu nedenle son zamanlarda, spesifik DNA sekanslarınısaptayan yeni aygıtların geliştirilmesi için büyük bir çaba harcanmaktadır.Bu çalışmada, CaMV 35S promotör sekansının hibridizasyon reaksiyonunu saptayanQCM tabanlı bir DNA biyosensörü geliştirilmeye çalışılmıştır. Proboligonükleotidlerinin kuvartz kristalin altın yüzeyine bağlanması için gerekli olanyüzey kaplama metodunun seçimi için çalışmalar yapılmıştır. İki kaplama metodudenenmiş ve bunlar yüzeye bağlanan probun miktarı, hibridizasyona etkisi,rejenerasyon kapasitesi ve hedefe özgül olma özellikleri bakımından incelenmiştir.İki kaplama metodu da kendi halinde oluşan tek yüzeylerin kullanımı esasınabağlıdır. Biri, tiol grubu taşıyan P35S prob oligonükleotidin yüzeye bağlanması için,tiol ve altının etkileşimini içerir. Diğeri ise, amin grubu taşıyan oligonükleotidin altınviyüzeye bağlanması için yüzeyin aldehit grupları ile fonksiyonel hale getirilmesiniiçerir. Sensör yüzeyinin fonksiyonelleştirilmesi, plazma polimerizasyonu yöntemikullanılarak yüzeye kaplanan etilendiamin monomerinin gluteraldehit ileaktifleştirilmesi yoluyla sağlanmıştır.Elde edilen sonuçlar, tiol grubu ile yüzeye kaplama yapılan probların daha iyikaplama özellikleri gösterdiğini, hibridizasyon reaksiyonu sırasında daha yüksekhassasiyet sağladığını, özgül olmayan bağlanma yapmadığı ve rejenerasyonbasamaklarına karşı daha dayanıklı olduğunu göstermiştir.Tiol prob için optimize edilmiş kaplama yöntemi, PZR ile çoğaltılmış ve pflp geniaktarılmış tütün bitkisi DNAsında P35S gen dizisinin saptanması amacıylakullanılmıştır. Kromozomal DNAların parçalanması, kesici enzimler kullanılarak yada yüksek ses dalgaları yardımı ile sağlanmıştır. DNA örnekleri ile yapılançalışmalar, geliştirilen QCM bazlı DNA biyosensörünün PZR ile çoğaltılmamışDNA örneklerinde hedef gen dizisinin direkt olarak saptadığını göstermiştir.Elde edilen sonuçlar, geliştirilen QCM bazlı DNA biyosensörünün, genetiğideğiştirilmiş organizmaların saptanması amacıyla kullanılabilecek gerçek zamanlı,işaretsiz ve direkt bir sistem olabileceği yönünde ümit vaad etmektedir.Anahtar sözcükler: DNA-bazlı biyosensörler; Genetiği değiştirilmiş organizmalar(GDO); CaMV P35S; immobilizasyonvii.