SUMMARYThe regeneration of NADH in the reaction has great importance because thecofactor required by the enzymatic reactions carried out in the industry is veryexpensive. NAD + -dependent formate dehydrogenases (EC 1.2.1.2) catalyse theoxidation of formate anion into carbon dioxide, coupled with the reduction of NAD +to NADH. Regeneration of NADH using formate dehydrogenase is easy andinexpensive. However, the activity of these enzymes is not sufficient for industrialuse. In this study, it is aimed to investigate of the role of R258 and H311 positions ofCandida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism by proteinengineering.Mutagenesis for H311 and R258 aminoacid positions of CmFDH, which arethought to present in the active-site of the enzyme, was performed by the ISM-CASTmethod. Primers containing NRT degenerative codon was used for mutagenesis.Wild-type and mutant CmFDHs were expressed in E.Coli BL21 (DE3) cells in auto-induction Studier medium. Then the proteins were purified by using Ni-NTAHisTrap column. Activity and kinetic measurements of mutant CmFDHs werecarried out and kinetic parameters were compared to the wild type CmFDH. Steady-state kinetic studies were performed against both formate and NAD + and Michaelis-Menten kinetic parameters were calculated. Approximately 200 colonies for theR258 library and 70 colonies for the H311 library were scanned. R258S, H311S,H311C, H311Y mutant CmFDHs were obtained, however these mutations did notshow any measurable activity. When compared to wild-type CmFDH, the H311Dmutant of CmFDH showed an increase in catalatic efficiency.These results show that selected positions are functional amino acids forenzyme activity. Modeling studies are still in progress to better understand theinteraction of new amino acids with the substrate in selected positions and the role ofthese positions in enzyme activity.

ÖZETEndüstride gerçekleştirilen enzimatik reaksiyonlarda ihtiyaç duyulankofaktörlerin pahalı olmasından dolayı, reaksiyon ortamındaki kofaktörlerinyenilenmesinin önemi büyüktür. NAD + -bağımlı format dehidrogenazlar (EC 1.2.1.2)karbonil grubunun oksidasyonunu katalizleyerek ürün olarak CO 2 oluştururken,NAD + ' i, NADH' e indirgerler. Endüstride kullanımı yaygın olan NADH' in formatdehidrogenaz enzimi kullanılarak yenilenmesi, kolay ve ucuz bir yöntemdir. Fakat buenzimlerin aktivitesi endüstride kullanım için yeterli değildir. Bu çalışmada, Candidamethylica format dehidrogenaz (CmFDH) enziminin R258 ve H311 pozisyonlarınınreaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi hedeflenmektedir.CmFDH enziminin aktif bölgesinde bulunduğu düşünülen H311 ve R258amino asit pozisyonlarına Tekrarlayan doyurulmuş mutasyon (ISM) - Kombine aktifbölge doyurulmuş test (CAST) yöntemi ile protein mühendisliği uygulanmıştır.CmFDH H311 ve R258 pozisyonları için dejeneratif kodon içeren primerlertasarlanarak, mutasyonlar gerçekleştirilmiştir. Otoindüksiyon-Studier besiyerindeE.Coli BL21 (DE3) hücrelerinde ifade edilmesi sağlanan, yabanıl tip ve mutantenzimler, Ni-NTA HisTrap kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Mutantların aktiviteve kinetik ölçümleri yapılarak yabanıl tip ile karşılaştırılmıştır. Format ve NAD +substrat olarak kullanılıp kararlı hal kinetik çalışmaları gerçekleştirilerek, Michaelis-Menten kinetik değerler hesaplanmıştır. Yaklaşık olarak R258 kütüphanesi için 200koloni, H311 kütüphanesi için 70 koloni taranmıştır. R258S, H311S, H311C, H311Ymutant CmFDH' lar elde edilmiş ama bu mutasyonlarda formata karşı ölçülebilir biraktivite görülmemiştir. Yabanıl tip CmFDH ile kıyaslandığında H311D mutantCmFDH' ın katalitik verimliliğinde artış görülmüştür.Elde edilen bu sonuçlar, seçilen pozisyonların enzim aktivitesi için fonksiyonelamino asitler olduğunu göstermiştir. Seçilen pozisyonlarda yeni amino asitlerin,substrat ile olan etkileşiminin görülmesi ve enzimin aktivitesindeki rolünün dahadetaylı anlaşılması için modelleme çalışmaları halen devam etmektedir.