Besides physiological processes in the body, spatio-temporal changes in intracellular Ca2+ signaling is known to play a crucial role in carcinogenesis. Store-operated Ca2+ Entry (SOCE) is one of the major Ca2+ entry pathways in non-excitable cells including hepatocellular carcinoma (HCC) cells to regulate intracellular Ca2+ homeostasis. In recent studies, the main reason of the reoccurrence of cancer after treatments has been shown to be the presence of the tumor initiating cells (TICs) in the heterogeneous tumor cell population. Therefore, the purpose of this study is to delineate the role of SOCE in phenotypical differentiation of TICs found in Huh7 HCC cell line expressing specific cell surface markers, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) and CD133. For this purpose, we investigated the Ca2+ homeostasis mechanism and performed target validation on functional SOCE in these cell subpopulations (EpCAM+CD133+ or TICs). We initially separated the TICs from parental cells via a flow cell sorter cytometer (Fluorescent Activated Cell Sorter, FACS) by the help of fluorophore-conjugated specific antibodies targeting their cell surface antigens of interest. We, secondly, have the cells overexpress the two functionally important components of SOCE, an endoplasmic reticulum (ER) integral membrane protein of endoplasmic reticulum (ER) that senses intra luminal Ca2+ content, stromal interaction molecule (STIM1) and a membrane Ca2+ influx protein (Orai1), in these cells. We, then, investigated their role in real time changes in intracellular Ca2+ dynamics, cellular proliferation, drug resistance (MDR1 gene expression, P-glycoprotein), EMT marker mRNA expression, and cellular invasion-migration properties as well as their capability of in vitro carcinogenesis. Based on our data, ER Ca2+ release and SOCE were found to be higher in TICs compared to the EpCAM-CD133- cells. This may explain how TICs avoid apoptosis, possibly buffering the excess amount of Ca2+ in ER in to prevent mitochondrial Ca2+ uptake which is necessary for triggering apoptosis. Slow proliferation rates of TICs comparable to that of the parental cells, might be the resulted of Ca2+ buffering mechanism that holds these cells in an undifferentiated state. Overexpressing (OE) the SOCE components, STIM1 and Orai1, in TICs led to an effective SOCE in EpCAM+CD133+ STIM1+Orai1- OE cells. This observation suggested us that there might be a stoichiometric relationship between STIM1 and Orai1 expressions also described by others. In multidrug resistance (MDR) experiments, among STIM1- OE, Orai1- OE and STIM1+Orai1-OE constructs STIM1+Orai1- OE has the highest expression level of MDR1 gene suggesting a causal relationship between SOCE and MDR development in TICs. In the epithelial to mesenchymal transition (EMT) experiments, we evaluated the transcription levels of EMT markers, E-cadherin (epithelial), N-cadherin and vimentin (mesenchymal), in STIM1-OE and STIM1+Orai1 OE TICs. In this regard, elevation of both epithelial and mesenchymal markers suggested us the presence of partial EMT, an interphase between EMT and complete EMT. Based on our functional and genomic analyses, STIM1 and Orai1 would be important for ER Ca2+ buffering capacity and SOCE entry operation mechanism, respectively, crucial upstream events for cellular survival. Targeting the TICs for SOCE components STIM1-Orai1 and their related signaling pathways as well as manipulating related miRNAs can support development of specific anticancer strategies.

Hücre içi Ca+2 sinyal iletiminin yer ve zamana bağlı değişimleri vücutta fizyolojik işlevlerin yanı sıra karserleşme sürecinde de önemli işlev gördüğü bilinmektedir. SOCE (Depo kontrollü Ca+2 girişi) uyarılamayan hücrelerde HCC'yi (hepatocellular carcinoma) de kapsayan önemli Ca+2 giriş yolağı olup hücre içi Ca+2 homeostazını da düzenler. Günümüzde, yapılan çalışmalarda tedavi sonrası kanserin nüks etmesinin ana nedeninin heterojen tümör popülasyonunda bulunan tümör başlatıcı hücrelerin (Tumor-initiating cells, TIC) olduğunu gösterilmiştir. Bu nedenle, çalışmamızda, , EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) ve CD133 yüzey antijeni ifade eden Huh7 HCC hücre hattının alt popülasyonu olan TIC'lerin (EpCAM+CD133+) fenotipik farklılaşmasında SOCE işlevinin aydınlatılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, EpCAM+CD133+ popülasyonunda SOCE ilişkili Ca+2 homeostazı araştırılmış ve hedef validasyonu yapılmıştır. Bu amaçla, parental Huh7 hücrelerinden hücre yüzey antijeniyle etkileşen floresan özellikli spesifik antikorlar ile akış sitometrisinde TIC'ler ayrıştırılmıştır. Daha sonra, SOCE'nin iki önemli bileşeni, intraluminal Ca+2 içeriğinin algılanmasından sorumlu olan integral membran proteini STIM1 (stromal interaction molecule) ve hücre membranda bulunan bir Ca+2 geçiş proteini olan Orai1'i, bu hücrelerde aşırı düzeyde ifade edilmesi sağlanmıştır. Daha sonra, hücre içi Ca+2 dinamiklerindeki değişim, hücre proliferasyonu, ilaç direnci (MDR1 gen ifadesi, P-glikoprotein), EMT (epitelden mezenkimale geçiş) belirteçlerinin ifadesini ve karsinogenezdeki migrasyon-invazyon özelliklerini incelenmiştir. Bulgular, ER Ca+2 salıverilişi ve SOCE'nin TIC'lerde EpCAM-CD133- hücrelere göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu gözlem, TIC'lerin fazla Ca+2'yi ER'de tamponlayarak ve mitokondriyal Ca+2 alımını önleyerek apoptozdan kaçabileceklerini düşündürmüştür. TIC'lerin EpCAM-/CD133- hücrelere göre daha yavaş prolifere olmaları Ca+2 tamponlayıcı mekanizmaların bu hücreleri farklılaşmamış halde tutmasından kaynaklanabilir. SOCE bileşenleri STIM1 ve Orai1'in aşırı düzeyde ifade edilmesi (STIM1+Orai1 OE) TIC'lerde SOCE yanıtını artırmıştır. Bu durum, başka araştırmacılar tarafından da tanımlanan, STIM1 ve Orai1 arasında sitokiyometrik bir ilişkinin olduğunu düşündürmektedir. Çoklu ilaç direnci (MDR) çalışmalarında STIM1 OE, Orai1 OE ve STIM1+Orai1 OE grupları arasında en fazla MDR1 gen ekspresyonu STIM1+Orai1 OE'nin göstermesi TIC'lerdeki MDR gelişimi ve SOCE arasında etkileşim olabileceğini göstermektedir. Epitelden mezenkimale geçiş deneylerinde, EMT belirteçlerinin (epitelyal E-cadherin; mezenkimal: N-cadherin ve Vimentin) mRNA düzeyleri STIM1 OE ve STIM1+Orai1 OE TIC'lerde test edildi. Her iki epitelyal ve mezenkimal belirteçlerin ifadelerinin fazla olması bir ara faz olan kısmi (parsiyel) EMT olabileceğini göstermiştir. İşlevsel ve genomik analizlerimize dayanarak STIM1 ve Orai1'in ER'de Ca+2 tamponlama kapasitesi, SOCE giriş mekanizması ve hücresel sağkalım üst sinyalizasyon yolaklarında önemli olduğunu göstermektedir. TIC'lerde SOCE bileşenleri ile ilgili sinyal yolaklarının ve ilişkili miRNA'ların hedeflenmesi özgül antikanser tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde yardımcı olacaktır.