The Effect of Beta-Adrenergic Ligands on Breast Cancer Cell RegulationActivation of β2-AR (beta2-Adrenoceptor) can reduce basal pERK1/2 (phosphorylated extracellular signal regulated kinases ½) level and inhibit proliferation of MDA-MB231 breast cancer cells. In the present study we aimed to understand the mechanism of β2-AR mediated ERK1/2 de-phosphorylation. Firstly we examined the role of PKA (protein kinase A), DUSP1/6 (dual specificity phosphatase 1 and 6), and PP1/PP2A (serine/threonine phosphatase 1 and 2), which are known to be regulators of ERK1/2 phosphorylation. We investigated the effect of DUSP1/6 inhibitor, (E)-2-benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one (BCI), PP1/ PP2A inhibitor Calyculin A and PKA inhibitor (H89) on β2-AR mediated de-phosphorylation of pERK1/2 and determined the expression of DUSP1, DUSP6, pDUSP1, PP1, PP2A, pPP1 and pPP2A proteins. We also determined total DUSP1 mRNA levels.Relative levels of proteins were measured by Western blotting. Cell proliferation was assessed by WST-1 kit and iCellegence system. mRNA levels were determined by Real Time PCR.β2-AR stimulation by agonists lead to de-phosphorylation of basal pERK1/2, pDUSP1 (ser359) and pPP1 (Threonine 320, inhibitor form of PP1), increased total DUSP1 levels and also inhibited MDA-MB231 cell proliferation. BCI and Calyculin A completely, H89 partially antagonized the β2-AR mediated de-phosphorylation of ERK1/2. Terbutaline stimulation increased the expression of total DUSP1 protein and enhanced the active form of PP1. PKA inhibitor (H89) partially antagonized β2-AR mediated tDUSP1 increase and inhibited β2-AR mediated de-phosphorylation of pPP1. We also performed experiments in order to explore the relationship between β2-AR mediated ERK1/2 de-phosphorylation and inhibition of the cell proliferation. In the present study although β2-AR mediated ERK1/2 de-phosphorylation diminished after 24 hours, we observed that at least 72 or 96 hour of β2-AR stimulation is required in order to get access to inhibition of MDA-MB231 cell55proliferation. PKA inhibitor H89 did not inhibit cell proliferation and did not change the antiproliferative effect of β2-AR stimulation.These results showed that β2-AR mediated de-phosphorylation of ERK1/2 is related to the activity of DUSP1/6 and PP1. Although PKA takes part in the regulation of β2-AR mediated ERK1/2 dephosphorylation and increased PP1 activity and total DUSP1 protein expression, it has no effect on β2-AR mediated cell proliferation inhibition. Our data showed that despite the fast desensitation of ERK1/2 response, long time β2-AR stimulation is required in order to inhibit MDA-MB231 cell proliferation. β2-AR mediated pERK1/2 de-phosphorylation cannot explain inhibition of MDA-MB231 cell proliferation so further studies are required to clarify it.Keywords: MDA-MB231, Beta-2 Adrenergic Receptor, ERK1/2, Proliferation, Protein Phosphatase.

Beta-Adrenerjik Reseptör Ligandlarının Meme Kanseri Hücrelerinin Regülasyonuna EtkisiMDA-MB231 kanser hücresinde β2-AR (beta 2 adrenerjik reseptör) uyarısı bazal fosforile ERK1/2'i (extracellular signal regulated kinases 1/2) ve hücre proliferasyonunu inhibe etmektedir. Bu çalışmada β2-AR aracılı, ERK1/2 defosforilasyonunun mekanizmasının aydınlatılması ve bu yanıtın β2-AR aracılı antiproliferatif etkideki rolünün araştırılması amaçlandı. Bu amaçla öncelikle ERK1/2 fosforilasyonun regülasyonunda rolü olduğu bilinen PKA (protein kinaz A), DUSP1/6 (dual specificity fosfataz 1 ve 6), ve PP1/PP2A (serine/threonine fosfataz 1 ve 2) rolü araştırıldı. Bunun için DUSP1/6 inhibitörü, (E)-2–benzylidene–3-(cyclohexylamino)–2,3-dihydro-1H-inden-1-one (BCI), PP1/PP2A inhibitörü Calyculin A ve PKA inhibitörü H89'un β2-AR uyarısı ile gözlemlenen, pERK1/2 defosforilasyonuna etkisi, DUSP1, DUSP6, pDUSP1, PP1, PP2A, pPP1 ve pPP2A protein düzeyleri saptandı. Total DUSP1 mRNA düzeyi ölçüldü.Çalışılan tüm proteinlerin göreceli mikterları Western blot analizi ile ölçüldü. Hücre proliferasyon deneyi WST-1 kiti ve iCellegence sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. mRNA düzeyi ise Real Time PCR ile saptandı.β2-AR uyarısı ile bazal pERK1/2, pDUSP1 (ser359) ve pPP1 (PP1'in inhibitör formu, treonin 320 fosforilasyonu) düzeyinde azalma, tDUSP1 düzeyinde ise artış meydana geldi, ayrıca MDA-MB231 hücre proliferasyonunda inhibisyon gözlemlendi. BCI ve Calyculin A, β2-AR uyarısı ile gözlemlenen pERK1/2 defosforilasyonunu tamamen inhibe ederken H89 ise kısmi fakat önemli düzeyde bir inhibisyona neden oldu. Terbutalin ile stimülasyon, total DUSP1 ekspresyonunu ve PP1 aktivitesini arttırdı. PKA inhibitörü (H89) varlığında, β2-AR uyarısı ile artan tDUSP1 seviyelerinde kısmen inhibisyon meydana geldi, azalmış pPP1 seviyelerinde ise inhibisyonun ortadan kalktığı gözlemlendi. Ayrıca bu bulgulara ek olarak, β2-AR uyarısı ile oluşan ERK1/2 inhibisyonu ile hücre proliferasyonun inhibisyonu arasındaki bağlantıyı araştırmaya yönelik çalışmalar gerçekleştirildi. Bu çalışmalarda β2-AR agonistlerin ERK1/2aktivitesini inhibe edici etkisinin 24 saatlik uyarı sonunda ortadan kalkmasına rağmen, MDA-MB231 hücre proliferasyonunun inhibisyonu için agonistlerle 72 ve 96 saatlik β2-AR uyarısının gerektiği gözlemlenmiştir. PKA inhibitörü H89 β2-AR aracılı ERK1/2 inhibisyonunu engellemesine rağmen hücre proliferasyonunu ve β2-AR uyarısı ile gözlemlenen antiproliferatif etkiyi değiştirmedi.Bu sonuçlar DUSP1/6 ve PP1 enzimlerinin, β2-AR uyarısı ile oluşan ERK1/2 defosforilasyonunda rolü olabileceğini göstermektedir. PKA'nın, β2-AR uyarısı ile azalan ERK1/2 aktivitesinde, artan PP1 aktivitesinde ve artan tDUSP1 seviyelerinde rolü olduğu görülmektedir. Bir diğer taraftan PKA inhibisyonunun, β2-AR aracılı ERK1/2 inhibisyonunu engellemesine rağmen β2-AR aracılı antiproliferatif etki üzerinde rolü yoktur. Ayrıca β2-AR aracılı ERK1/2 aktivitesindeki inhibisyonun hızla ortadan kalkmasına rağmen MDA-MB231 hücre proliferasyonunun inhibisyonu için uzun süreli β2-AR uyarısı gerekmektedir. Bu sonuçlar β2-AR aracılı antiproliferatif etkinin ERK1/2 inhibisyonu ile açıklanamayacağını ve ek çalışmalar ile bu yolağın aydınlatılması gerektiğini düşündürmektedir.Anahtar Kelimeler: MDA-MB231, Beta-2 Adrenerjik Reseptör, ERK1/2, Proliferasyon, Protein Fosfataz.