Breast cancer is the most common malignancy in women, only in Europe with an incidence of 450,332 cases in 2008. Estrogen receptors (ERs) and estrogen signaling regulate key events in breast cancer development and progression. Estrogen receptor status is an important prognostic factor and antiestrogen (endocrine) therapy is the choice of first-line treatment in ER-positive breast cancer cases. However, most tumors develop resistance to endocrine therapies during the course of treatment. Thus, a better understanding of estrogen receptor signaling, including non-genomic, non-transcriptional components, is essential for developing effective treatments and predicting endocrine therapy response. Programmed cell death/apoptosis is essential for development and homeostasis of tissues and the mitochondrial apoptotic pathway is regulated by members of the BCL-2 protein family. Impaired cell death signaling promotes cancer cell survival in response to a myriad of cellular damage or stress, including chemotherapy, hypoxia and oncogenic stress. BH3-only BCL-2 proteins integrate cellular damage into mitochondrial apoptotic pathway by selectively interacting with antiapoptotic BCL-2 proteins. This selective binding pattern is translated into a functional mitochondrial cell death priming assay, designated as BH3 profiling, which allows us to assess the apoptotic blocks employed by cancer cells.The goal of our study was to determine how mitochondrial estrogen receptors affect mitochondrial cell death priming and endocrine therapy response in breast cancer cells by using innovative techniques such as confocal immunofluorescence microscopy, coimmunoprecipitation, 3D spheroid cell culture and BH3 profiling assay. Our results demonstrate the differential expression of estrogen receptor isoforms at both RNA and protein levels. ER-α expression is selectively but ER-β is ubiquitously expressed in breast cancer cells and in normal cells. Endocrine therapy agents have similar EC50 values regardless of ER-α and ER-β expression statuses pointing out that these agents exert their anti-cancer actions by growth arrest, consequently resulting in cell death. Breast cancer cells have different mitochondrial priming status. According to the non-parametric Spearman correlation test, there is a correlation between BH3 profiles and endocrine therapy response as following: Sensitivity to Tamoxifen correlates with Bmf and Noxa levels in all breast cancer cell lines (n=40) (p < 0.05). Sensitivity to Anastrozole correlates with Hrk levels in all breast cancer cell lines (n=40) (p < 0.05). Sensitivity to Tamoxifen correlates with Hrk and Bmf levels in normal breast epithelial cell lines (n=4) (p < 0.05). Immunofluorescence analysis revealed mitochondrial localization of both receptors in addition to nucleus and cytoplasm. These studies provide new information on mitochondrial estrogen signaling, which help in the design of applicable tests to predict endocrine therapy resistance and facilitate tailored pharmacological interventions targeting estrogen receptors in breast cancer.

Östrojen reseptörlerini (ER) ve östrojen sinyal ileti yolağını hedefleyen endokrin terapileri meme kanseri tedavisinde ve önleyici/koruyucu yaklaĢımlarında çok önemli bir bileĢendir. Ancak, bazı ER + tümörler endokrin tedavisine cevap vermezken, bazıları da tedavi sürecinde direnç geliĢtirebilmektedir. Dolayısı ile rasyonel hasta ve tedavi seçimi, inaktif ilaçların gereksiz toksisitesinden kaçınmak ve sağlık harcamalarının topluma maliyetini düĢürmek için baĢarı oranı yüksek öngörü araçlarını geliĢtirmemiz gerekmektedir. Aynı zamanda östrojen sinyal ileti yolaklarının non-genomik, non-transkripsiyonel bileĢenlerini daha iyi anlamamız ve endokrin terapisine direnç mekanizmalarını ortaya koymamız, var olan meme kanseri tedavileri/koruyucu yaklaĢımlarından çok daha etkili yöntemleri geliĢtirmemizi sağlayacaktır. Projemizin amacı meme kanseri hücrelerinde mitokondriyal östrojen reseptörlerinin mitokondriyal hücre ölümü eğilimi ve endokrin terapisine cevabı nasıl etkilediğini ortaya koymaktır. Bu amaç çerçevesinde sistematik olarak meme kanseri hücre panelimizdeki hücrelerin mitokondriyal hücre ölümü eğilimlerini belirlenmiĢ ve bu hücrelerin klinikte kullanımda olan endokrin terapi ilaçlarına duyarlılıkları taranmıĢtır. ER-α ve ER-β eksprese eden ER + ve triple-negatif ER - hücrelerinden müteĢekkil hücre panelimizde gerçekleĢtirdiğimiz çalıĢma literatürde meme kanserinde ilk mitokondriyal hücre eğilimi-endokrin terapisine cevap korelasyon çalıĢmasıdır. Ayrıca BH3 profilleme yönteminin öngörü gücünü test etmiĢ ve elde edilen bulgular ileride klinik meme kanseri patoloji örnekleriyle yapılacak çalıĢmaların temeli niteliğindedir.Elde edilen sonuçlara göre, ER-α hücre spesifik gen anlatımı gösterirken, ER-β tüm hücrelerde mevcuttur. Endokrin terapi ajanları hücrelerin ER durumlarına bağlı olmaksızın benzer EC50 değerleri göstererek büyüme inhibisyonunun ileri sonucu olarak hücre ölümünü iĢaret etmektedir. Meme kanseri hüreleri farklı mitokondriyal hücre ölümü eğilimi cevabı ortaya koymuĢtur: Parametrik olmayan Spearman korelasyon testine göre, BH3 profilleri ve endokrin terapi ajanları arasında Ģu Ģekilde korelasyon vardır: Tamoxifen‟e duyarlılık BMF ve NOXA seviyesi ile tüm meme kanseri hücrelerinde korelasyon göstermiĢtir (n=40) (p < 0.05). Bunun yanında Anastrozole duyarlılık tüm meme kanseri hücrelerinde HRK seviyesiyle korelasyon göstermiĢtir (n=40) (p < 0.05). Normal meme epiteli hücrelerinde ise tamoxifene duyarlılık HRK ve BMF seviyesi ile korelasyon göstermiĢtir (n=4) (p < 0.05). Immunofluoresan sonuçları her iki reseptörün de hücredeki dağılımlarının sadece çekirdekte değil, mitokondri, hücre membranı ve sitoplazma gibi çekirdek-dıĢı kompartmanlardada varlığını ortaya koymuĢtur. Bu kapsamda elde edilen sonuçlar bize mitokondriyal ER tarafından endokrin terapisine cevaben düzenlenen hücre ölümü ya da sağkalımı mekanizmaları konusunda çok önemli bilgiler sağlamıĢtır. Bu bilgiler, meme kanseri tümörlerinin yaklaĢık %70‟inin ER + olduğu göz önüne alınırsa endokrin terapisine cevabın dinamiklerini anlamamız ve yeni tedavi stratejileri geliĢtirmemiz için fırsatlar sunacaktır. Bu çalıĢmadan elde edilen bulguların yayımlanması ile uluslarası meme kanser biyolojisi ve hücre ölümü bilgi havuzuna katkı yapmayı hedeflenmiĢ olup, özellikle BH3 profilleme yönteminin endokrin terapisi için öngörücü bir platform olarak ilk çalıĢmasının yapılması bu testin klinik uygulamasına geçiĢ için anahtar bir basamak görevi görecektir. Yine mitokondriyal ER‟nin hücre ölüm eğilimi ve endokrin terapisine cevap açısından rollerinin açıklanması ile mitokondriyal ER‟ni spesifik olarak hedefleyen küçük moleküllerin geliĢtirilmesinin bilimsel temelini oluĢturmasına olanak sağlayacaktır.