Circadian clock is an internal time keeping system recurring 24 hour daily rhythm in physiology and behavior of organisms. Circadian clock contains transcription and translation feedback loop involving CLOCK/NPAS2, BMAL1, Cry1/2 and Per1/2. In common, heterodimer of CLOCK/NPAS2 and BMAL1 binds to E-box element in the promoter of Per and Cry genes in order to activate their transcription. CRY and PER making heterodimeric complexes enter the nucleus in order to inhibit their own BMAL1:CLOCK activated transcription. The aim of this study was to investigate and quantify real time binding affinities of clock proteins among each other on and off DNA modes using Surface Plasmon Resonance (SPR). The pair wise interaction coefficients among clock proteins, as well as interaction of PER2, CRY2 and PER2:CRY2 proteins with BMAL1:CLOCK complex in the presence and absence of EBOX motif have been investigated via analysis of SPR data with pseudo first order reaction kinetics approximation, and via nonlinear regression curve fitting. The results indicated that CRY2, PER2 and BMAL1, CLOCK proteins form complexes in vitro, and that PER2, CRY2 and PER2:CRY2 complex has similar affinities towards BMAL1:CLOCK complex. CRY2 protein had the highest affinity toward EBOX complex while PER2 and CRY2:PER2 complexes displayed low affinity toward EBOX complex. The quantification of the interaction between clock proteins is critical to understand the operation mechanism of the biological clock, to address the behavioral and physiological disorders, and will be useful for the design of new drugs towards clock related diseases.

Memelilerde biyolojik saat 24 saatlik döngü içerisinde organizmanın uyuma-kalkma döngüleri esnasında, birtakım biyokimyasal ve davranışların 24 saatlik ritme göre düzenlenmesini sağlayan hücre içi sinyal mekanizmaları bütünüdür. Moleküler düzeyde saatin 24 saatlik döngüde düzenlenmesi KRİPTOKROM, PERYOD, CLOCK ve BMAL1 proteinleri tarafından gerçekleştirilmektedir. BMAL1:CLOCK ikilisi promotör bölgesindeki E-kutusuna bağlanarak genlerin ifadesini sağlarken, KRİPTOKROM ve PERYOD ikilisi, BMAL1:CLOCK ikilisi ile etkileşerek saate bağlı genlerin anlatımını baskılamaktadır. Bu çalışmada biyolojik saat mekanizmasının temel öğelerinin birbiri ile etkileşim dinamiğini belirlemek için psödo birinci dereceden reaksiyon mekanizması kullanılarak Yüzey Plazma Rezonans (Surface Plasma Resonance (SPR)) tekniği ile dört saat proteinin (KRİPTOKROM2, PERYOD2, CLOCK ve BMAL1) ikili etkileşme dinamiği ve kompleksler halinde etkileşme dinamiği E-kutusu gen motifinin varlığı ve yokluğu esnasında ölçülmüştür. Bu dinamiğe göre incelenen dört saat proteinlerininin ikili etkileşimlerinden en kuvvetli ilişkinin PER2-KRI2 ve BMAL1:CLOCK ikililerinin arasındaki ilişkilerin en kuvvetli oldukları gözlenmiş, bağlanma sabitlerinin 7.54-9.00 (± 0.73) nM ve 3.60-6.90 (±1.86) nM aralıklarında oldukları hesaplanmıştır. KRI2 proteininin BMAL1:CLOCK:EBOX kompleksi ile birleşme eğilimi PER2 ve KRI2:PER2 proteinlerinin EBOX kompleksine olan birleşme eğiliminden daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Saat proteinleri arasındaki bağlanma değerlerinin belirlenmesi sadece insan fizyolojik verilerini derinden etkileyen biyolojik saati anlamamıza yardımcı olmakla kalmayıp saate bağlı hastalıkların giderilmesi için ilaç tasarımı yapma olanağı sağlayacaktır.