World is heading towards a post-antibiotic era due to emergence of antibioticresistance. Several fatal infectious diseases caused by antibiotic resistant bacteria cannotbe treated anymore using the existing antibiotic surplus. Novel antibiotics or novelstrategies to use antibiotic more efficiently are therefore crucial to combat againstresistance. However, both of these approaches require a clear understanding ofantibiotic resistance at molecular and genetic levels. Here in this study, we studiedevolutionary dynamics of trimethoprim resistance under dynamically sustained drugselection. Using a custom made continuous culture device that we call the Morbidostat;we evolved drug sensitive Escherichia coli cells against increasing levels oftrimethoprim adapting strong or mild dilution rates. First, using Illumina whole genomesequencing and Sanger sequencing, we identified trimethoprim resistance conferringmutations in dihydrofolate reductase (folA) gene and the order that these mutationsappear in the population. Our results suggest that clonal interference between differentgenotypes is common and longer under strong dilution where trimethoprim stress isapplied in shorter and steeper pulses. Second, we cloned and purified dihydrofolatereductase (DHFR) enzymes with single mutations and carried out biochemical assays toquantify mutant enzymes' enzymatic activities. Our preliminary results showed thatDHFR mutants have slightly worse substrate affinity (higher km values) but up to ~20fold elevated catalysis rate (kcat/km) compared to their wild type ancestor. We concludethat trimethoprim-resistance-conferring DHFR mutations decrease affinity to bothenzyme's substrate and competing drug molecules, yet enzymatic activity, which isessential for folic acid synthesis, is still adequately efficient to maintain bacterialfitness.

Günümüz dünyası bakterilerin antimikrobiyal ilaçlara direnç kazanması nedeniyleantibiyotiklerin tamamıyla etkisiz hale geleceği güne doğru bir geçiş yaşıyor. Bir çokölümcül bulaşıcı hastalık antibiyotiklere dirençli hale gelmiş bakteriler nedeniyle yakıngelecekte tedavisiz kalacak. Yeni antibiyotikler ve yeni tedavi yöntemleriningeliştirilmesi ve bunlarla beraber antibiyotik direnci kazanılmasının önüne geçilmesiçok büyük önem taşıyor. Bu problemin çözülmesi adına yapılması gereken bakterilerinantibiyotik direnci kazanması işleminin genetik ve moleküler aşamalarını anlamak. Buçalışmada trimetoprim antibiyotiğine karşı direnç kazanılmasının evrimsel temellerinifarklı seçilim baskıları altında inceledik. Bu amaç doğrultusunda bakterilerin eşit birşekilde seçilim baskılarıyla karşılaşmasına ve bakteri büyümesinin sürekli kontrolaltında tutulmasına izin verebilen Morbidostat adlı makineyi kullandık. Bakteriler güçlü(Uzun süreli antibiyotik enjeksiyonuna) ve zayıf (kısa süreli antibiyotik enjeksiyonu)olmak üzere iki farklı seçilim baskısı altında antibiyotik direnci kazandılar. İlluminatüm genom sekanslama ve Sanger gen sekanslanması yöntemleriyle öncelikle deneyinsonucunda direnç kazanılmasına yol açan mutasyonları belirledik, sonrasındadihidrofolat reduktaz enzimi üzerinde görmüş olduğumuz bu mutasyonların, hangisırayla kazanıldığını anlamak için günlük alınmış olan örnekleri sekansladık.Sonuçlarımızda güçlü seçilim baskısı altındaki popülasyonlarda genotipik çeşitlilik,zayıf seçilim gösteren popülasyonlara göre daha uzun süreli ve yaygın olarak görüldü.İkinci olarak gördüğümüz bu mutasyonları birer birer yabanıl protein üzerindedeğişikliğe uğratıp deneyde gördüğümüz mutasyonların reaksiyonun biyokimyasınaetkisini çalıştık. Elimizdeki ilk sonuçlar gösterdi ki; mutant proteinler yabanıl olanlakarşılaştırıldığında, substrat affinitesi (Km) adına biraz kötü olsa da reaksiyonunkatalizinde (Kcat/Km) 20 kata kadar daha etkili oldular. Sonuç olarak trimethoprimdirenci kazanılmasında gerekli mutasyonlar, enzimin substratına karşı ilgisini azaltmışolsa da bakterinin hayatını devam ettirmesi adına çok önemli olan folat sentez yolununçalışmasında daha etkili oldukları için bakteri popülasyonlarının Darwinsel uyumunusağlamış oldular.