Aim of the study: The increasing prevalence of bacterial resistance to antibiotics is an important public health problem. Infections due to carbapenem resistant Enterobacteriaceae strains are among the most important health problems in our country as well as in the world. Infections caused by carbapenem resistant bacteria are associated with significant morbidity and mortality worldwide. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae are among the top tier of the WHO list of antibiotic-resistant `priority pathogens` that pose the greatest threat to human health. The aim of this study is to develop a procedure to detect carbapenemase activity by MALD-TOF MS and it is aim to to calculate the sensitivity and specificity of the developed method. The second aim of this study is to determine the distribution of resistance genes of carbapenem-resistant K. penumoniae strains isolated in our hospital using real time PCR.Material and methods: Between January 2017- February 2019 K. pneumoniae strains (n=74) isolated and stocked from blood culture samples in Ege University Hospital Bacteriology Laboratory were included in the study. Klebsiella pneumoniae NCTC 13438 was used as positive control and Escherichia coli ATCC 25922 was used as negative control. First, MIC values of the isolates were determined by imipenem, meropenem and ertapenem gradient test (BioMérieux, France). Then, the strains were investigated by using real time PCR (BD MAX™ CRE Assay, BD Diagnostic Systems, Canada) to detect blaKPC, blaOXA-48 and/or blaNDM carbapenem resistance genes. A method was developed using ertapenem for the determination of carbapenemase activity by MALDI-TOF MS (BioMérieux, France) of all strains. It was evaluated whether two and four hours incubation of the bacteria in ertapenem solution carried out ertapenem hydrolysis with using MALDI-TOF. Sensitivity and specificity of MALDI-TOF MS were determined by PCR. Results: 9 strains were susceptible to the imipenem, meropenem and ertapenem. 65 strains were resistant to imipenem, meropenem and ertapenem. Imipenem, meropenem and ertapenem MIC50 and MIC90 values of all resistant strains were > 32 mg/L. BlaOXA-48, blaNDM and blaKPC were not detected in any of the carbapenem susceptible strains. Of the 65 strains resistant to any of the carbapenems, 57 (87.7%) had blaOXA-48, 15 (23.1%) had blaNDM, and 4 (6.2%) had blaKPC. BlaOXA-48 and blaNDM genes were detected together in 11 (16.9%) strains. The sensitivity and specificity of MALDI-TOF MS at the second hour were 83.1% and 100%, respectively. Sensitivity and specificity at the fourth hour were 100%. MALDI-TOF MS showed that 54 strains resistant to carbapenems hydrolyze ertapenem at second hour; All carbapenem resistant strains were found to hydrolyze ertapenem at the 4th hour. Carbapenem susceptible strains did not hydrolyze ertapenem.Conclusion: In our hospital, blaOXA-48 and blaNDM were detected 87.7% and 23.1% respecively. The sensitivity and specificity of MALDI-TOF MS at the second hour were 83.1% and 100%, respectively. Sensitivity and specificity at the fourth hour were 100%. In the MALDI-TOF MS ertapenem hydrolysis test, false negative results were observed at the second hour. These originated from OXA-48-producing origins. Determination of carbapenemase activity by MALDI-TOF MS is an evolving and promising method. MALDI-TOF MS provides information on the carbapenemase activity of the bacteria in two to four hours. After bacterial identification, it can be used to show carbapenemase activity on the same day. Multiple samples can be tested at the same time. Can be used in the presence of an outbreak. It is an easy test because routine laboratory materials are used in this method. Spectrum analysis is subjective because it is performed manually.

Amaç: Karbapenem dirençli Enterobacteriaceae enfeksiyonları tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de en önemli sağlık sorunlarından birisi olup bu enfeksiyonlarının mortalite ve morbiditesi oldukça yüksektir. Karbapenem dirençli Enterobacteriaceae; DSÖ'nün oluşturduğu, insan sağlığı için ciddi tehdit oluşturan antibiyotiğe dirençli `öncelikli patojenler` listesinin en üst sıralarında yer almaktadır. Bu çalışmada, karbapenemaz aktivitesini kısa sürede saptama amacıyla MALDI-TOF MS'in kullanımına yönelik bir yöntem geliştirilmesi ve geliştirilen yöntemin duyarlılık ve özgüllük değerlerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Ayrıca hastanemizde soyutlanan karbapenem dirençli K. pneumoniae kökenlerinde direnç gen dağılımlarının real time PCR kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: Ocak 2017- Şubat 2019 tarihleri arasında Ege Üniversitesi Hastanesi Bakteriyoloji Laboratuvar'ında kan kültürlerinden soyutlanıp, stoklanmış olan 74 adet K. pneumoniae kökeni çalışmaya dahil edildi. Pozitif kontrol olarak Klebsiella pneumoniae NCTC 13438, negatif kontrol olarak Escherichia coli ATCC 25922 kullanıldı. Kökenlerin öncelikle imipenem, meropenem ve ertapenem gradient test (BioMérieux, Fransa) ile MİK değerleri belirlendi. Daha sonra kökenlerde real time PCR (BD MAX™ CRE Assay, BD Diagnostic Systems, Kanada) ile blaKPC, blaOXA-48 ve/veya blaNDM araştırıldı. Tüm kökenlerde karbapenemaz aktivitesinin MALDI-TOF MS (BioMérieux, Fransa) ile araştırılmasında ertapenem kullanılarak bir yöntem geliştirildi. PCR ile karşılaştırılarak MALDI-TOF MS ertapenem hidroliz testinin ikinci ve dördüncü saatlerdeki duyarlılık ve özgüllüğü belirlendi.Bulgular: Gradient test yöntemi ile 74 kökenin 65'i test edilen her üç karbapenem ajana karşı dirençli, dokuzu ise duyarlı bulundu. Dirençli kökenler için imipenem, meropenem ve ertapenemin hem MİK50 hem de MİK90 değerleri >32 mg/L saptandı. Duyarlı dokuz kökenin hiçbirisinde blaOXA-48, blaNDM ve blaKPC saptanmadı. Karbapenem dirençli olan 65 kökenin 57'sinde (%87.7) blaOXA-48, 15'inde (%23.1) blaNDM, 4'ünde (%6.2) blaKPC saptandı. 11 (%16.9) kökende blaOXA-48 ve blaNDM birlikte saptandı. Dirençli 65 kökenin 54'ü ikinci saatte ertapenemi hidrolize ederken 11 kökende yanlış negatif sonuç elde edildi. Yöntemin ikinci saatteki duyarlılık ve özgüllük oranları sırasıyla %83.1 ve %100 olarak hesaplandı. Dirençli kökenlerin tamamı dördüncü saatte ertapenemi hidrolize etti. Yöntemin dördüncü saatteki duyarlılık ve özgüllük oranı %100 olarak hesaplandı. Karbapenem duyarlı kökenlerin hiçbirisi iki ve dört saatlik inkübasyonlarda ertapenemi hidrolize etmedi. Sonuç: Çalışmamızda en sık saptanan karbapenemaz tipi %87.7 oranı ile OXA-48 olup bunu ikinci sıklıkta %23,1 oranı ile NDM izlemektedir. Kökenlerin 11'inde OXA-48 ve NDM birlikte saptandı. Hastanemizde KPC ilk defa bu çalışmada saptandı. Geliştirilen yöntemin ikinci saatteki duyarlılık oranı dördüncü saate göre daha düşük saptandı. İki saatlik inkübasyon sonrası 11 kökende yanlış negatif sonuç elde edildi. Bu kökenlerin tamamında OXA-48 saptandı. Yine bu 11 kökenin üçünde eş zamanlı olarak NDM'nin de bulunduğu belirlendi. Laboratuvarda klinik örneklerden gram negatif bakteriler soyutlandığında; geliştirilen bu yöntem karbapenemaz aktivitesini rutin duyarlılık testlerinden daha kısa sürede aynı gün içerisinde (2-4 saatte) saptamaya olanak sağlamaktadır. Eş zamanlı olarak birden fazla köken çalışılabilir. MALDI-TOF MS ile karbapenemaz aktivitesinin saptanması, henüz gelişme aşamasında olan hızlı, ucuz, umut verici bir yöntemdir.