Allele-specific Emulsion PCR (asePCR) as a Liquid Biopsy Method for Residual Tumor Detection

Bedri KARAKAS

doi:https://doi.org/10.21673/anadoluklin.441594

Makale detayları

Allele-specific Emulsion PCR (asePCR) as a Liquid Biopsy Method for Residual Tumor Detection

Yazarlar:

Bedri KARAKAS

Yayıncı:

Hayat Sağlık ve Sosyal Hizmetler Vakfı

Ana Başlıklar:

Sağlık teşvikleri

Dergi:

Anatolian Clinic the Journal of Medical Sciences 2019 Vol.24 Issue 1, pp.47-52

Belge Tipi:

Makale

Yayın Tarihi:

1/2019

Belge Dili:

İngilizce

Document ID (Org No.):

2000864824

Sıklık:

Üç Yıllık

eISSN:

2458-8849

pISSN:

2149-5254

DOI:

https://doi.org/10.21673/anadoluklin.441594

Anahtar kelimeler:

Özet:

 


Aim

This study aimed to develop an allele-specific emulsion polymerase chain reaction (asePCR)technique for detection of cell-free circulating tumor DNA (ctDNA) in the blood plasma of cancer patients. 

Materials and Methods

Genomic DNA extracted from normal (wild-type) and thyroid cancer (mutant) cell lines (MCF10A and B-CPAP) were used to obtain specific dilution series (spike-in) of mutant DNA with wild-type DNA. Two sequential PCR steps (regular and asePCR) were performed with specifically designed primers for each step to detect the spiked-in mutant DNA fraction within the wild-type normal DNA. The DNA products amplified by regular PCR were used as templates in the asePCR where specific reverse primers were designed to amplify either the mutant or wild-type allele while a common forward primer was covalently bound to the beads. The asePCR reaction mix was encapsulated in water-in-oil emulsion compartments and incubated in a thermocycler with specific PCR program settings. At the end of asePCR reaction, oil compartments were broken and DNA-coated beads were evaluated by FACS to determine the mutant and wild-type fractions for each sample.

Results

The asePCR technique successfully detected the mutant DNA in the background of wildtype DNA (0% mutant) as a proof-of-principle. A strong correlation (r2>0.99) was found between the expected mutant fraction and the fraction measured by asePCR. asePCR was sensitive and specific enough to consistently detect various low mutant DNA fractions in the background of wild-type DNA with no false positives in the wild-type sample.

Discussion and Conclusion

 Our asePCR can be used to detect mutant ctDNA in the plasma of cancer patients as a liquid biopsy method for tumor response evaluation and early detection of possible relapses.


.

 


Amaç

 Bu çalışmada kanser hastalarının kan plazmasında sirkülasyondaki hücresiz tümör DNA’sının (ctDNA) saptanışına yönelik alel-spesifik bir emülsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (asePCR) tekniği geliştirmek amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntemler

Normal tip DNA ile mutant DNA’nın spesifik seyreltisini (spike-in) elde etmek için, normal (doğal tip) ve tiroit kanserli (mutant) hücre hatlarından (MCF10A ve B-CPAP) ekstrakte edilen iki tip genomik DNA kullanıldı. asePCR tekniğimizi doğrulamak için BRAFV600E hotspot mutasyonu hedeflendi. İki sıralı PCR adımı (düzenli ve asePCR), normal DNA içindeki mutant DNA fraksiyonunu tespit etmek için her bir adım için özel olarak tasarlanmış primerler ile gerçekleştirildi. Düzenli PCR ile çoğaltılan DNA örnekleri, asePCR’de spesifik olarak tasarlanmış mutant ve normal tip alel-spesifik primerler ve ortak primer ile kovalent olarak bağlanmış olan tanecikler ile birlikte kullanılmıştır. asePCR reaksiyon karışımı, mineral yağ içinde su emülsiyon bölmelerinde kapsüllendi ve spesifik PCR program ayarları ile bir termosistörde inkübe edildi. asePCR reaksiyonunun sonunda, mineral yağ bölmeleri kırıldı ve DNA kaplı taneler FACS ile değerlendirildi ve her örnek için mutant ve normal tip fraksiyonları sayıldı.

Bulgular

AsePCR tekniği, prensip kanıtı olarak normal tip DNA’nın (%0 mutant) arka planında mutant DNA’yı başarıyla tespit etti. Bilinen mutant fraksiyonu ile asePCR ile ölçülen fraksiyon arasında güçlü bir korelasyon (r2>0,99) bulundu. AsePCR, normal tipteki örnekte hiçbir yanlış pozitiflik tespit etmediği gibi normal tip örnekteki DNA’nın arka planındaki çeşitli düşük mutant DNA fraksiyonlarını da tutarlı bir şekilde tespit edecek kadar hassas ve spesifikti.

Tartışma ve Sonuç

asePCR tekniğimiz, tümör yanıtını değerlendirmeye ve olası relapsları erken teşhise yönelik bir sıvı biyopsi yöntemi olarak, kanser hastalarının plazmasında mutant ctDNA tespiti için kullanılabilir.

.

Makale detayları

Allele-specific Emulsion PCR (asePCR) as a Liquid Biopsy Method for Residual Tumor Detection

Yazarlar:

Bedri KARAKAS

Yayıncı:

Hayat Sağlık ve Sosyal Hizmetler Vakfı

Ana Başlıklar:

Sağlık teşvikleri

Dergi:

Anatolian Clinic the Journal of Medical Sciences 2019 Vol.24 Issue 1, pp.47-52

Belge Tipi:

Makale

Yayın Tarihi:

1/2019

Belge Dili:

İngilizce

Document ID (Org No.):

2000864824

Sıklık:

Üç Yıllık

eISSN:

2458-8849

pISSN:

2149-5254

DOI:

https://doi.org/10.21673/anadoluklin.441594

ctDNA

cfDNA

dijital PCR

emülsiyon-PCR

kanser

sıvı biyopsi

Sayı

Makale detayları

Allele-specific Emulsion PCR (asePCR) as a Liquid Biopsy Method for Residual Tumor Detection

Yazarlar: Bedri KARAKAS

Yayıncı: Hayat Sağlık ve Sosyal Hizmetler Vakfı

Ana Başlıklar: Sağlık teşvikleri

Dergi: Anatolian Clinic the Journal of Medical Sciences 2019 Vol.24 Issue 1, pp.47-52

Belge Tipi: Makale

Yayın Tarihi: 1/2019

Belge Dili: İngilizce

Document ID (Org No.): 2000864824

Sıklık: Üç Yıllık

eISSN: 2458-8849

pISSN: 2149-5254

DOI: https://doi.org/10.21673/anadoluklin.441594

ctDNA

cfDNA

dijital PCR

emülsiyon-PCR

kanser

sıvı biyopsi

Sayı

Yazarlar:

Bedri KARAKAS

Yayıncı:

Hayat Sağlık ve Sosyal Hizmetler Vakfı

Ana Başlıklar:

Sağlık teşvikleri

Dergi:

Anatolian Clinic the Journal of Medical Sciences 2019 Vol.24 Issue 1, pp.47-52

Belge Tipi:

Makale

Yayın Tarihi:

1/2019

Belge Dili:

İngilizce

Document ID (Org No.):

2000864824

Sıklık:

Üç Yıllık

eISSN:

2458-8849

pISSN:

2149-5254

DOI:

https://doi.org/10.21673/anadoluklin.441594